沉默JP2基因对小鼠心肌细胞SK2通道的影响*

郭文静，樊红琨，郑春光，张桂红，段 萍，杨 阳，罗天霞，章 茜#

1)郑州大学基础医学院生理学教研室 郑州450001 2)河南护理职业学院生理学教研室 安阳455001

Junctophilins(JPs)是偶联细胞膜与细胞内质网离子通道交通的分子基础，并具有膜偶联复合物(junctional membrane complexes，JMCs)特性的一类蛋白［1-2］。已知JPs 存在4种亚型，分别为JP1、JP2、JP3 和JP4。JP2 主要存在于骨骼肌和心肌，敲除JP2 可导致兴奋-收缩失偶联，进而引起心肌和骨骼肌收缩障碍［3-4］。SK 通道是依赖于细胞内Ca2+激活的K+通道，其中SK2 通道存在于心肌细胞膜，包括T 管膜［5］。研究［6］表明SK2 通道参与动作电位复极化过程，与室上性心律失常发生的分子机制相关。作者之前的研究［7］表明细胞内Ca2+稳态可影响SK2 通道的功能。该实验采用RNA 干扰(RNAi)技术研究沉默JP2 基因，观察对新生小鼠心肌细胞(neonatal mouse cardiomyocytes，NMCMs)SK2 通道的影响。

1 材料与方法

1．1 靶向小鼠JP2 的siRNA 慢病毒质粒的构建根据siRNA 的设计原则及文献［8］报道，针对Gen-Bank 中小鼠JP2 基因(NM_001205076．1)的2个不同 位 点(5'-GCCACAATGTGCTGGTCAA-3'，5'-GT GATCTTGCTGAA-3')，分别设计2 对靶向JP2 基因并带Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的DNA 互补序列和RNAi阴性对照(negative control，NC)序 列(5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3')。经Blast 软件分析确定序列的特异性。上述序列的合成及重组慢病毒质粒(LV-JP2-RNAi-1、LV-JP2-RNAi-2 和LV-NCEGFP)的包装和收获由上海吉凯基因有限公司完成。

1．2 NMCMs 的培养 取出生1～2 d 的昆明小鼠心脏剪碎，37℃低速离心，用含EDTA 的胰蛋白酶(Hyclone 公司)消化，收集细胞悬液，离心，弃上清，用含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12 培养基(美国Gibco 公司)重悬细胞。将细胞悬液接种于35 mm 培养皿，37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育90 min。取上清接种于24 孔板，加入5-Brdu 使其终浓度为0．1 mmol/L，37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育，36 h 后换液。

1．3 重组慢病毒质粒感染NMCMs 将生长良好、融合至50% 的细胞分为4组，分别转染LV-JP2-RNAi-1、LV-JP2-RNAi-2 和LV-NC-EGFP，以未转染细胞(Ctrl-NC)作对照，48 h 后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况。2．5 g/L 胰蛋白酶消化NMCMs。收集各组细胞，流式细胞仪(美国BD公司)检测感染效率。

1．4 实时荧光定量PCR 检测JP2 mRNA 的表达收集感染48 h 的细胞，采用Trizol 法抽提总RNA，37℃DNase 处理，合成cDNA 第一条链(上海生工生物工程技术服务有限公司)。JP2 基因引物序列:上游5'-CTGGCTATCCTATTTGTTCAC CT-3'，下 游5'-GTTTTAGGTCCGAAGTCCCAT-3'，产物大小135 bp。内参(GADPH)基因引物序列:上游5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3'，下游5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3'，产物大小183 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。PCR 总反应体系为20 μL。反应条件:95℃2 min;95℃10 s，60℃40 s，40个循环。制备熔解曲线:95℃变性1 min，冷却至55℃，使得DNA 双链充分结合;从55℃起到95℃，每一步增加0．1℃，保持4 s，同时读取吸光度值。实验重复3次。JP2 mRNA 以其与内参基因吸光度比值作为相对表达量。

1．5 Western blot 检测SK2 通道蛋白的表达 收集感染72 h 细胞，－80℃冰箱储存备用。提取各组细胞蛋白，100 g/L SDS-PAGE 分离SK2，电泳，转膜，50 g/L 脱脂牛奶-TBS 室温封闭1 h，加入兔多克隆抗SK2 抗体(1 ∶300 稀释，Alamone labs)或β-actin (1∶600 稀释，美国Sigma 公司)，4℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000 稀释)，室温孵育2 h，ECL 化学发光曝光显影。

1．6 统计学处理 应用SPSS 17．0 对数据进行分析，采用单因素方差分析和SNK-q 检验比较各组间JP2 mRNA 表达的差异，检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 重组慢病毒质粒对NMCMs 的感染 NMCMs生长状态良好，形态正常(图1A)，倒置荧光显微镜下可见明显的GFP 表达(图1B)。Ctrl-NC组心肌细胞的转染效率为0，LV-JP2-RNAi-1 和LVJP2-RNAi-2组心肌细胞转染效率分别达70% 和80%。

图1 NMCMs 慢病毒质粒转染的观察(×10)

2．2 各组细胞JP2 mRNA 水平 见表1。

表1 各组细胞JP2 mRNA 表达水平

2．3 各组细胞SK2 通道蛋白的表达 与Ctrl-NC及LV-NC-EGFP组细胞比较，LV-JP2-RNAi-2组细胞SK2 通道蛋白的表达明显被抑制，见图2。

图2 各组细胞SK2 通道蛋白的表达

3 讨论

在心肌细胞，由T 管膜和肌质网膜形成二联体膜偶联复合物，后者是实现心肌兴奋-收缩偶联的重要结构基质［9］。SK2 通道表达于心肌细胞膜，包括T 管膜，细胞内Ca2+浓度的变化是激活SK 通道的惟一因素［10］。JP2 功能异常可影响细胞膜表面离子通道与细胞内Ca2+的偶联，直接影响心肌或骨骼肌兴奋-收缩偶联过程，导致收缩障碍，如果敲除JP2，动物将于胚胎期死亡［11-12］。

RNAi 是一种序列特异性的、由双链RNA 诱导的基因沉默现象，siRNA 可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数周甚至更久，具有经济、快捷、高效等显著优势，成为RNAi 研究的首选方法［13］。该实验构建靶向JP2 的siRNA 慢病毒载体，流式细胞仪检测结果表明它可在心肌细胞内有效表达。该研究将该慢病毒载体转染至NMCMs，可有效地沉默心肌细胞JP2 mRNA 表达，并可抑制小鼠心肌细胞SK2 通道的表达。

总之，该实验结果为深入研究JP 与SK 通道在小鼠心肌动作电位中的作用及分子机制奠定了基础。

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