防感合剂的定性定量方法优化研究

张传仙 高骁君 倪文澎

（江苏省中医院药学部，江苏 南京 210029）

江苏省中医院制剂防感合剂是我院著名中医儿科泰斗江育仁教授经验方，由古方桂枝加龙骨牡蛎汤并加黄芪而成。方中桂枝辛温，甘草甘温，二药相合，有辛甘化阳之功，以鼓舞卫阳；白芍味酸，与甘草合用酸甘化阴，以补营阴之不足；姜枣内可调脾胃，外可和营卫，脾胃健而营卫通。龙骨、牡砺同具潜阳敛阴之功用。黄芪益气固表，实卫而敛汗，且具有较强的健脾之功；陈皮、白术健脾理气。临床用于防治小儿呼吸道感染，疗效确切[1]。

作为医院制剂，其质量标准中，鉴别项仅对白芍所含的白芍苷进行薄层鉴别，未对处方中其他药味进行鉴别，更没有含量测定。实验研究中，我们在防感合剂原标准的基础上，对白芍的薄层鉴别方法进行了耐用性试验，并增加了炙黄芪和白术的薄层色谱鉴别，用HPLC-ELSD方法对方中君药炙黄芪中黄芪甲苷建立了含量测定方法[2]。实验结果表明，建立的方法可靠，重现性好，可以更好地控制制剂的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

凝胶成像分析仪（型号WD-9413A，北京市六一仪器厂）；电热恒温鼓风干燥箱（型号DHG-9123A，上海精宏实验设备仪器厂）；医用超声波清洗仪，型号KQ-1000E，昆山市超声仪器有限公司；薄层色谱展开槽、硅胶-0.5CMCNa板(自制)；Waters2695高效液相色谱仪；Alltech-2000型ELSD检测器，电子分析天平（BP-211D型，德国赛多利斯公司）。

1.2 试药

白芍对照药材（批号120905-201109，中国食品药品检定研究院）；芍药苷对照品（批号110736-201337，中国食品药品检定研究院）；黄芪甲苷对照品（批号110781-201314，中国食品药品检定研究院）；白术对照药材（批号110786-200503，中国食品药品检定研究院）；防感合剂（批号1401001、1401002、1401003，江苏省中医院制剂部）；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

防感合剂制剂处方由十一味中药组成，原制剂薄层鉴别仅白芍一味饮片的鉴别，现对白芍的鉴别进行了方法学研究，并增加本制剂中炙黄芪、白术薄层色谱鉴别试验。

2.2.1 白芍的薄层鉴别

2.2.1.1 白芍的薄层鉴别方法的建立

供试品溶液的制备：取防感合剂10ml，用正丁醇萃取两次，每次30ml，合并正丁醇萃取液，用氨试液洗涤两次，每次20ml，弃去氨试液，将正丁醇液水浴蒸干，残渣加无水乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；

阴性样品溶液的制备：按防感合剂制备方法制备缺白芍药材的阴性制剂，按上述方法制备阴性样品溶液；

白芍对照药材溶液的制备:取白芍对照药材粉末0.5g，加乙醇10ml，振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。

芍药苷对照品制备：取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液作为对照品溶液。

薄层层析：参照薄层色谱法（《药典》一部附录ⅥB） [3]，在同一硅胶G薄层板上，吸取上述三种试液各4µl分别点样，展开剂为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2），取出，晾干，喷5%香草醛硫酸试液，105℃烘干至斑点清晰。

在硅胶G板上，与对照品色谱相应的位置上，供试品溶液显相同颜色的斑点。该法分离度好，阴性样品没有干扰，用此法对三批样品进行同步试验，三批均能检出，结果如图1，拟建立白芍的鉴别标准。

图1： 防感合剂中白芍薄层图谱

2.2.1.2 白芍鉴别方法的耐用性考察[4]

2.2.1.2.1 不同薄层板的耐用性考察

取上述的供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液各4µl，分别点于自制的硅胶G板与青岛海洋化工厂预制硅胶G上，按2.2.1.1建立的白芍薄层鉴别方法实验，结果如图2、图3。从图中可知，两种板分离度均可，预制板中主斑点的Rf值较小，可能与制板时粘合剂的浓度有关，并没有影响分离效果。进行了三批样品多次实验，重现性良好。

2.2.1.2.2 温湿度对分离度的影响

取上述的供试品溶液、阴性溶液、对照品溶液各4µl，分别点于两相同来源硅胶G板上，按

图2： 自制硅胶G板白芍薄层结果图

图3：预制G板白芍薄层结果图

2.2.1.1建立的薄层鉴别条件，分别在温度25℃、湿度50%和温度30℃、湿度70%两条件下展开，取出，晾干，显色。结果如图4、图5。结果显示，分离度较好，重现性好。

图4： 25℃、50%白芍薄层鉴别结果图

图5： 30℃、50%白芍薄层鉴别结果图

2.2.2 炙黄芪薄层鉴别

2.2.2.1 炙黄芪的薄层鉴别方法的建立

供试品溶液制备：取防感合剂50ml，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并萃取液，氨试液洗涤至无色，弃去氨试液，用蒸馏水洗涤2-3次，每次30ml，将正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

阴性样品溶液的制备：按防感合剂制备方法制备缺炙黄芪的阴性制剂，按上述方法制备阴性样品溶液；

对照品制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液。

薄层层析：参照薄层色谱法（《药典》一部附录ⅥB） [2]，在同一硅胶G薄层板上，吸取上述三种试液各2µl分别点样，展开剂为三氯甲烷-甲醇-20%氢氧化钠（13：7：2）的下层溶液，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105℃烘干至斑点清晰。

在硅胶G板上，在与对照品色谱相应的位置上，供试品溶液在日光下显相同棕褐色斑点；紫外灯光（365nm）下显相同橙黄颜色的斑点。此方法分离度好，阴性样品没有干扰，用此法对三批样品进行同步试验，均能检出，结果如图6。拟建立炙黄芪的鉴别标准。

图6 ：防感合剂炙黄芪薄层图谱

2.2.2.2 炙黄芪鉴别方法的耐用性考察[4]

2.2.2.2.1 不同薄层板的耐用性考察

取上述供试品溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液各2µl，分别点于自制的硅胶G板与青岛海洋化工厂硅胶G，按2.2.2.1建立的炙黄芪薄层鉴别方法实验，结果如图7、图8。从图中可知，两种板分离度均可，预制板中主斑点的Rf值较小，可能与制板时粘合剂的浓度有关，并没有影响分离效果。进行了三批样品多次实验，重现性良好。

图7： 自制硅胶G板炙黄芪薄层结果图

图8： 预制硅胶G板炙黄芪薄层结果图

2.2.2.2.2 温湿度对分离度的影响

取上述的供试品溶液、阴性溶液、对照品溶液各2µl，分别点于两相同来源的硅胶板上，按2.2.2.1建立的薄层鉴别条件,分别在温度25℃、湿度50%和温度30℃、湿度70%两条件下展开，取出，晾干，显色。结果如图9、图10。结果显示，分离度较好，重现性好。

2.2.3 白术薄层鉴别

2.2.3.1 白术的薄层鉴别方法的建立

供试品溶液制备：取防感合剂50ml，用正己烷萃取两次，每次20ml，合并萃取液，挥干，残渣加2ml乙醇溶解，作为供试品溶液；

阴性样品溶液的制备：按防感合剂制备方法制备缺白术的阴性制剂，按上述方法制备阴性样品溶液；

图9： 25℃、50%炙黄芪薄层鉴别结果图

图10: 30℃、50%炙黄芪薄层鉴别结果图

对照药材制备：取白术对照药材粉末1g，加正己烷4ml，超声30min，过滤，滤液作为对照药材溶液。

薄层层析：参照薄层色谱法（《药典》一部附录ⅥB），在同一硅胶G薄层板上，吸取上述三种试液各10µl分别点样，展开剂为环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（4：1：2），取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，烘干，置365nm紫外灯下检视。

在硅胶G板上，与对照药材色谱相应位置上，供试品溶液显相同颜色的荧光斑点。此方法分离度好，阴性样品没有干扰，用此法对三批样品进行同步试验，均能检出，结果如图11，拟建立白术的鉴别标准。

2.2.3.2 白术鉴别方法的耐用性考察[4]

2.2.3.2.1 不同薄层板的耐用性考察

取上述的供试品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液各10µl，点于自制的硅胶G板与青岛海洋化工厂预制硅胶G，按2.2.3.1建立的白术薄层鉴别方法实验，结果如图12、图13。从图中可知，两种板分离度均可。进行了三批样品多次实验，重现性良好。

2.2.3.2.2 温湿度对分离度的影响

图11： 防感合剂白术薄层图谱

图12： 自制硅胶G板白术薄层结果图

图13： 预制G板白术薄层结果图

上述的供试品溶液、阴性溶液、对照品溶液各10µl，分别同时点于两相同来源的硅胶G板上，按2.2.3.1建立的薄层鉴别条件，分别在温度25℃、湿度50%和温度30℃、湿度70%两条件下展开，取出，晾干，显色。结果如图14、图15。结果显示，分离度较好，重现性好。

上述薄层鉴别方法的耐用性考察实验结果显示，斑点清晰，分离度好，Rf值合适，可以将白的薄层鉴别方法列为防感合剂的质量标准。

图14： 25℃、50%白术薄层鉴别结果图

图15： 30℃、50%白术薄层鉴别结果图

2.3 定量研究

增加本制剂君药炙黄芪中黄芪甲苷的含量测定项目，研究如下。

2.3.1色谱条件[2]

色 谱 柱：HederaC18 ODS-2（4.6 mm × 250 mm，5 µm）；流动相：乙腈-水（32：68）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 µl。

2.3.2 对照品溶液制备

取经五氧化二磷减压干燥24h的黄芪甲苷对照品12.50mg，精密称定，加甲醇适量，溶解，加甲醇定容置25 mL容量瓶中，制得浓度为500.00µg·mL-1的对照品溶液。

2.3.3 供试品制备

取防感合剂50ml，水饱和正丁醇萃取4次，每次40mL，合并萃取液，以氨试液洗涤5次，每次约40 mL，弃去氨试液，收集正丁醇液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 阴性对照溶液制备

取炙黄芪的缺味阴性制剂，按2.3.3项下的方法处理、制备炙黄芪阴性供试品溶液[1]。

2.3.5 专属性试验

将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液分别进样，HPLC图见图16。图中可见，理论塔板数按黄芪甲苷峰计算不低于5000，样品基线平稳，分离度良好，且无阴性干扰。

图16 黄芪甲苷HPLC-ELSD色谱图

2.3.6 线性关系考察

取上述对照品溶液，分别进样5、10、20、30、40、50 µL，依法测定峰面积。横坐标为进样量对数，纵坐标为峰面积对数，进行分析，得y =1.6909x + 5.1937，r =0.9991，结果表明黄芪甲苷在进样量2.5~25 µg与峰面积呈良好线性关系，如图17。

图17 黄芪甲苷线性关系考察

2.3.7 精密度试验

精密吸取对照品溶液15µl，重复进样6次，测定并计算，结果以黄芪甲苷峰面积计算RSD为0.68%。

2.3.8 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号1408001），按上述色谱条件，分别于0、2、4、8、12 、24h进样，进样量为20µl，经测定并计算，结果以黄芪甲苷峰面积计算RSD为1.35%，说明供试品溶液在24h内稳定。

2.3.9 重复性试验

取供试品溶液（批号1408001），分6份，进样20µl，测定，计算，结果平均含量为：黄芪甲苷0.048 mg·mL-1，RSD以黄芪甲苷含量计算为1.13%。

2.3.10 加样回收试验

精密吸取已知含量的供试品溶液(批号：1408001)6份，分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液，按2.3.3项下供试品方法配制得加样回收的供试品溶液，进样量为30µl，测定，计算回收率及其RSD值。结果平均回收率101.03%，RSD=0.73%值，表明方法回收率良好，准确度可靠。

2.3.11 样品含量测定

分别取不同批号防感合剂（批号1401001、1401002、1401003），依上述方法制备成样品供试品溶液，每批取3份，依法测定，结果见表1。

表1 三批防感合剂中黄芪甲苷含量

3 讨论

3.1 方中白芍、炙黄芪的薄层鉴别方法，斑点分离度高，直观，重现性好。在本试验中，进行耐用性实验考察了不同薄层板(青岛海洋化工厂、自制硅胶G薄层板)、不同温度(25°C、30°C)、不同湿度(相对湿度50%、70%）对薄层鉴别的影响。结果表明，上述条件的改变对防感合剂中白芍、炙黄芪、白术的薄层鉴别没有明显影响。白术薄层鉴别中，参考相关文献[5-7]，展开取出晾干后，直接置于紫外灯365nm检视，色谱斑点不清晰，故优化方法，采用喷以10%硫酸乙醇显色，斑点清晰，效果较好。方中防风、桂枝的薄层鉴别方法参考药典，进行探索，但在防感合剂中鉴别点不明显，重现性差，故不作为防感合剂中饮片防风和桂枝的薄层鉴别方法。

3.2 由于方中药材种类较多，中药饮片的成分较复杂，不同药材，可能含有相同的化学成分。因此，仅以化学成分对照品作为参考，特别是该成分为其非专属性成分时，难以作为饮片的定性鉴别依据。故本文建立的薄层鉴别方法白芍、白术增加对照药材作为参考，使得薄层定性鉴别的信息更加丰富，增强了定性鉴别的准确性与可靠性。

3.3 炙黄芪作为方中君药，其活性成分之一的黄芪甲苷也是特征性成分，具有补脾养血，益气生津，可改善心肺功能，扩张血管，调节机体免疫功能等。由于黄芪甲苷，它有微弱的紫外末端吸收，不宜采用UV检测器测其含量。DAD检测器对皂苷类成分紫外末端吸收弱，选用ELSD作为检测器，它能克服该缺点，适用于皂苷类成分的检测，故现在多采用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量[8-10]。本试验所建立的黄芪甲苷含量测定方法，经方法学考察表明所该法专属性强，重现性好，可用于防感合剂的质量控制。

3.4 防感合剂制剂处方由十一味中药组成，原制剂薄层鉴别仅白芍一味饮片的定性鉴别。现对白芍的鉴别进行了方法学研究，建立本制剂中炙黄芪、白术薄层色谱鉴别方法和炙黄芪中黄芪甲苷的HPLC-ELSD含量测定法。以上三味药材的薄层定性鉴别，黄芪甲苷的定量研究，经3批样品验证考察，方法专属性强、阴性无干扰，灵敏度高，重现性好。通过定性和定量方法两者的结合，可以更科学、更合理、更全面地进行的质量评价，故可作为该制剂质量标准提高的定性依据。

[1] 袁斌,孙轶秋,韩新民,等.防感口服液治疗小儿反复呼吸道感染非急性感染期60例临床观察[J].中国中医急症.2009.4（18）：519-520.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2010：284.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2010：96.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2010：附录131.

[5] 寿旦,俞忠明,章建民.改良的白术药材薄层色谱鉴别研究[J].中华中医药学刊，2011，29（3）：535-536.

[6] 李艳,胡红艳,黄秋明.白术护肝合剂中当归、白术、芍药的薄层色谱鉴别[J].中医学报, 2012，27（3）：343-344.

[7] 曲婷丽,邓亚宁,郝丽宏,等.参苓白术颗粒的薄层色谱鉴别方法研究[J].中成药，2008，30（12）：附4-附5.

[8] 李丹.高效液相色谱蒸发光散射检测法检测芪麦益气口服液中黄芪甲苷的含量[J].医药导报，2010，29（7）：941.

[9] 涂兴明. 高效液相色谱-蒸发光检测法测定伤骨健骨胶囊中黄芪甲苷的含量[J].中药材，2010，33（6）：999.

[10] 唐丽香. ELSD-HPLC法测定前列通胶囊中黄芪甲苷的含量[J].海峡药学，2010，22（8）：283.