半巢式RT—Realtime PCR检测南芥菜花叶病毒

粟智平++杨益娥++邓丛良++李金庆++王颖++段效辉

摘要 根据南芥菜花叶病毒（ArMV）外壳蛋白（CP）基因的保守序列，设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针，建立了半巢式RT-Realtime PCR检测ArMV的新方法。该方法有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式-RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大，也是对第一步PCR产物的确认，因此，检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。结果表明：该方法检测灵敏度可达0.06 fg/μL植物总RNA。

关键词 南芥菜花叶病毒（ArMV）；半巢式RT-Realtime PCR；检测

中图分类号 S41-30 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）18-0145-03

Dectection of Arabis Mosaic Virus by Semi-Nested RT-Realtime PCR

SU Zhi-ping 1 YANG Yi-e 2 DENG Cong-liang 3 LI Jin-qing 1 WANG Ying 1 DUAN Xiao-hui 1

（1 Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai Shandong 264000； 2 Huitong County Agriculture Bureau of Hunan Province；

3 Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Abstract Three nested primers and one TaqMAN probe were designed according to the CP gene of the Arabis mosaic virus，with which we set up a new method of semi-nested RT-Realtime PCR to detect the ArMV.The nest-PCR and the probe-detection technique were combined maneuverably in this study.The semi-nested RT-Realtime PCR in the second step could both magnify the sigal and validate the result of the first step，which could provide a more sensitive and specific detection of the ArMV.The sensitivity of the method could reach 0.06 fg/μL of total plant RNA.

Key words Arabis mosaic virus（ArMV）；Semi-Nested RT-Realtime PCR；dectection

南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）可侵染植物约174属215种，主要危害黄瓜、马铃薯、胡萝卜、樱桃、葡萄、草莓、大豆、菜豆等经济作物。其地理分布极广，在五大洲30余个国家有发生，属于世界性病害[1]。在我国未见该病毒危害的报道，是我国对外重要的检疫性植物病毒，是我国进境种子苗木必检项目，因此开发出快速、灵敏检测ArMV的技术的意义重大[2-3]。

目前，实时荧光PCR、电镜技术、RT-PCR、酶联免疫吸附测定（ELISA）等是我国南芥菜花叶病毒的主要检测技术[4-9]，但这些技术均有弊端。该文有机结合巢式PCR和实时荧光PCR技术，建立一套“半巢式RT-Realtime PCR”检测ArMV的分子技术。

1 材料与方法

1.1 试验材料

马铃薯黑环斑病毒（PBRSV）、马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）核酸、南芥菜花叶病毒（ArMV）、马铃薯X病毒（PVX），由中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所提供。核酸蛋白分析仪为BioPhotometer（德国eppendorf公司）；实时荧光PCR试剂盒，购自美国Invitrogen公司；实时荧光PCR基因扩增仪为ABI PARISM 7000（美国ABI公司）；纳米磁珠法植物总RNA提取试剂盒由北京出入境检验检疫局提供；反转录试剂盒（货号：DRR037A），购自大连宝生物公司（TaKaRa）。

1.2 TaqMAN探针与引物的设计合成

引物和TaqMAN探针由上海生工合成，探针3′端标记淬灭荧光染料tetra-methylcarboxyrhoda mine（TAMRA），5′端标记报告荧光染料6-carboxy fluorescent（FAM）。

该研究供设计3条引物，包括1条下游引物及2条上游引物。上游引物用ArMVF表示，其中ArMVF1序列为：5′-TGCTGAGTTTGAGGCAGCAA-3′，ArMVF2序列为：5-TGGGA AGCCCAACTTCATTT-3，下游引物用ArMVR表示，序列为：5′-CAGTGGTGGGATGGTCAGAAA-3′。TaqMan探针用PVXP表示，序列为：5′（FAM）-CGACTTTGCCAGCCTAGATGCAG-（TAMRA）3′。PCR产物长度ArMVF2/ArMVR为73 bp；ArMVF1/ArMVR为103 bp。3条引物及探针可以组成2套不同的反应组合，套1为ArMVF1/ArMVR/ArMVP，套2为ArMVF2/ArMVRArMVP。

1.3 总RNA提取及质量控制endprint

分别从感染上述病毒及健康的葡萄叶片（CK1）中用纳米磁珠法植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，为了获得其浓度与纯度值，测定其OD值（核酸蛋白分析仪BioPhotometer），并以此控制核酸质量。

1.4 反转录合成cDNA

用反转录试剂盒DRR037A分别将“1.3”中提取的6个植物总RNA及DEPC水对照（CK2）进行反转录操作，以合成cDNA，具体反应体系参考文献[9]。

1.5 实时荧光PCR试验

1.5.1 引物探针特异性试验。模板分别是“1.4”中合成的7个cDNA，反应体系：在25 μL体系中分别加入PCR buffer（2×）12.5 μL，ROX 0.5μL，上游引物ArMVF1（或ArMVF2）（15 μmol/L）1 μL，下游引物（ArMVR）（15 μmol/L）1 μL，探针（ArMVP）（10 μmol/L）1 μL，cDNA 2.0 μL，补充DEPC水至25 μL，每个cDNA 至少设置2个重复；循环条件为50 ℃、2 min；95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，45 cycles；在ABI PARISM 7000仪器的96孔板中进行反应。

1.5.2 灵敏度试验。用灭菌后的DEPC处理水将从感染南芥菜花叶病毒（ArMV）的植物叶片中提取的总RNA分别稀释为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1及DEPC 水11个梯度，进行反转录合成cDNA，然后进行实时荧光PCR灵敏度试验。实时荧光PCR与反转录操作同前所述。

1.5.3 2套引物探针的扩增效率对比试验。为比较这2套引物探针的扩增效率，用同一个ArMV病毒cDNA为模板，分别用套1组合（ArMVF1/ArMVR/ArMVP）和套2组合（ArMVF2/ArMVR/ArMVP）进行实时荧光PCR试验。实时荧光PCR操作同前。

2 结果与分析

2.1 特异性试验PCR扩增结果

套1（ArMVF1/ArMVR/ArMVP）结果见图1，套2（ArMVF2/ArMVR/ArMVP）结果见图2。可以看出，除了在ArMV的cDNA为模板的反应体系中出现标准的扩增曲线外，其他5种cDNA模板扩增信号均未出现，说明2套引物探针的特异性很好，与预计符合。

2.2 灵敏度试验PCR扩增结果

用DEPC处理水稀释为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、DEPC水11个梯度，稀释从带ArMV的叶片中提取植物总RNA。反转录分别合成cDNA后，进行实时荧光PCR扩增。套1和套2结果见图3、4。可以看出，当RNA稀释至10-9（即0.006 fg/μL）时，检测不到信号，因此该方法检测的灵敏度可达10-8，即0.06 fg/μL植物总RNA。

2.3 2套引物探针的扩增效率对比试验结果

套1组合（ArMVF1/ArMVR/ArMVP）和套2组合（ArMVF2/ArMVR/ArMVP）引物探针的扩增效率对比试验结果见图5。可以看出，这两引物探针的扩增效率几乎完全一样。

3 结论与讨论

实时荧光PCR技术将荧光信号的放大功能和PCR扩增系统有机结合起来，是口岸生物检测中的高新技术。较目前已报道的其他检测技术更快速、准确、灵敏和简便，在植物检疫中应用前景广阔[10-11]。

目前，关于南芥菜花叶病毒检测主要是ELISA检测与RT-PCR凝胶电泳方法，前者易产生假阳性结果，后者对实验室易造成污染。也有采用实时荧光PCR的报道。本研究建立了一个“半巢式Real-time PCR”检测南芥菜花叶病毒的方法，检测的灵敏度可达0.06 fg/μL植物总RNA。该方法既提高了检测灵敏度和准确性，又解决了由于不同方法而导致2次结果差异大、对结果难以判定的问题，能有效减少国际贸易中可能出现的贸易争端。

4 参考文献

[1] 洪键，李德葆，周雪平.植物病毒分类图谱[M].北京：科学出版社，2001.

[2] 张有才，陈宪斌，焦惠燕.南芥菜花叶病毒[J].植物检疫，1994，8（5）：284-285.

[3] 中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录[Z].2007.

[4] 南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法：SN/T 1150-2002[S].北京：中国标准出版社，2002.

[5] 邓丛良，梁新苗.郁金香上南芥菜花叶病毒的分子鉴定[C]∥中国植物病理学会学术年会论文，2006..

[6] 吴兴海，邵秀玲，张凤娟，等.南芥菜花叶病毒分子生物学快速检测方法的研究[J].江西农业学报，2007，19（7）：34-35.

[7] 闻伟刚，赵秀玲，翁志平，等.一步RT-PCR检测南芥菜花叶病毒方法的建立[J].植物检疫，2003，17（6）：331-332.

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[9] 邓丛良，吕玉峰.应用RT-Real time PCR检测南芥菜花病毒[J].植物检疫，2008，22（2）：80-82.

[10] 刘毅，丁元明，陈丽梅，等.进境百合种球南芥菜花叶病毒的检测及分子鉴定[J].植物检疫，2009（1）：7-9.

[11] 李彬，于翠，吴翠萍，等.进境荷兰郁金香种苗中南芥菜花叶病毒的鉴定[J].植物保护学报，2010（1）：19-24.endprint