高效液相色谱法测定饮料中的呋喃-2，5-二甲酸

汪 辉，李 莎，夏立新，2，彭新凯，2，李晰晖，周 鹏

(1．长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410013;2．湖南省食品安全生产工程技术研究中心，湖南 长沙 410013)

呋喃-2，5-二甲酸(FDCA)为白色粉末状固体，是重要的有机合成中间体，可用于制备各种烷基取代或酯类呋喃衍生物［1－2］，也可用于新型聚酯材料聚乙烯呋喃-2，5-二甲酸乙二醇酯(PEF)的合成［3］。在药理学方面，呋喃-2，5-二甲酸的二乙基酯具有与可卡因类似的麻醉作用，2，5-呋喃二甲酸钙盐具有抑制巨大芽孢杆菌生长的功能［1］。

近年来，基于可再生资源的呋喃芳香性聚合物材料越来越受关注［3］。PEF瓶也已大规模生产并用于食品饮料行业［4－5］。2014年10月，欧盟食品安全局发表的《关于安全评价的科学意见:呋喃-2，5-二甲酸，CAS:3238－40－2，用于食品接触材料》指出，当呋喃-2，5-二甲酸作为生产聚乙烯呋喃酸酯聚合物(PEF)的单体时，物质本身迁移到食品中的量若不超过5 mg/kg，则不会对人体构成威胁［6］。因此，建立饮料中呋喃-2，5-二甲酸的测定方法，有利于及时掌握PEF瓶中呋喃-2，5-二甲酸向饮料中的迁移情况，同时也可为食品安全监控提供有力的技术支撑。

目前，国内外测定呋喃类物质的方法有液相色谱(HPLC)法［7－8］和气相色谱－质谱(GC－MS)法［9－10］，主要用于测定呋喃醛、呋喃醇和呋喃一元酸，而关于呋喃二元酸的测定较少报道。陈天明［11］建立了红外光谱法测定呋喃二元酸的分析方法，但仅适用于高含量呋喃-2，5-二甲酸，而不适用于食品中微量和痕量呋喃-2，5-二甲酸的分析［12］。本方法结合呋喃-2，5-二甲酸的化学性质，采用高效液相色谱法测定其在饮料中的含量［13－14］，利用保留时间，结合紫外光谱定性，外标法定量，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

1260型高效液相色谱仪，配在线脱气机、四元泵、柱温箱、自动进样器和二极管阵列检测器(美国Agilent公司);SK－1型快速混匀器(江苏金坛医疗仪器厂);A10型超纯水处理器(美国Millipore公司)。

乙腈(色谱纯，德国Merck公司);冰乙酸(色谱纯，纯度≥99.5%，天津市化学试剂研究所);乙酸铵(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液的配制

准确称取10 mg呋喃-2，5-二甲酸于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配成100 mg/L的标准储备液，于4℃冷藏保存。使用时，用水逐级稀释成标准中间液，现配现用。

1.3 HPLC仪器条件

色谱柱为Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱温为40℃;流速为1.0 mL/min;流动相为0.02 mol/L乙酸铵(冰乙酸调至pH 3.5)－乙腈(50∶50)，等度洗脱;波长扫描范围为190～400 nm，检测波长为265 nm;进样量为10 μL。

1.4 样品前处理

准确称取样品9 g(精确至0.1 mg)，加水定容至10 mL，混匀后过0.45 μm微孔滤膜，滤液待测试用。

2 结果与讨论

2.1 波长的选择

配制5.0 mg/L呋喃-2，5-二甲酸溶液，不接色谱柱直接进样分析，采用二极管阵列检测器检测，波长扫描范围为190～400 nm。结果发现，呋喃-2，5-二甲酸在265 nm处有最大吸收，故本实验选择检测波长为265 nm。

2.2 色谱柱的选择

利用Ultimate AQ－C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)对呋喃-2，5-二甲酸进行检测，采用纯水作为流动相，但由于目标化合物的极性较大，其保留值较小。进一步考察了采用极性改性固定相的InspireTMHILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱和采用中性的酰胺键合基团的Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱对呋喃-2，5-二甲酸的测定情况，结果发现，前者较后者的保留能力弱，且目标化合物在不同pH值流动相(0.02 mol/L乙酸铵－乙腈)下均出现双峰。故本实验选择Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)为最佳色谱柱。

2.3 流动相的选择

考察了不同比例的0.02 mol/L乙酸铵(pH 6.8)－乙腈(60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80)作为流动相时的测定情况。结果发现，当0.02 mol/L乙酸铵(pH 6.8)－乙腈比例为20∶80时，目标化合物出现双峰;比例为30∶70时，色谱峰前延;比例为60∶40，50∶50和40∶60时峰形对称，但随着乙腈比例的升高，目标化合物的保留值增大，且响应值降低，考虑到长时间高比例水相会影响色谱柱的寿命，因此最终选择比例为50∶50的流动相。另外，考察了0.02 mol/L乙酸铵－乙腈(50∶50)流动相在不同pH值(pH 6.8，5.0，3.5)条件下对目标化合物的测定情况(见图1)，结果发现，目标化合物的保留值随着pH值的降低而升高;当采用0.02 mol/L乙酸铵(pH 3.5)－乙腈(50∶50)作为流动相时，目标化合物的峰形对称，保留值合适，分离度较高，因此实验选其作为流动相。

图1 呋喃-2，5-二甲酸在不同pH值流动相下的色谱图Fig.1 Chromatograms of furan-2，5-dicarboxylic acid in mobile phase system with different pH values

2.4 线性关系、灵敏度与仪器精密度

配制8个不同浓度的标准溶液，按本方法进行测定，以呋喃-2，5-二甲酸的质量浓度(X，mg/L)为横坐标，对应峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，呋喃-2，5-二甲酸在0.5～100 mg/L范围内线性关系良好，回归方程为Y=66.86X－5.780，相关系数(r2)为0.999 9。采用空白混合样品溶液稀释低浓度标准溶液，以信噪比S/N≥3确定方法的检出限(LOD)为0.15 mg/kg，以S/N≥10确定方法的定量下限(LOQ)为0.5 mg/kg。

图2 标准溶液与加标样品溶液的色谱图(5 mg/L)Fig.2 Chromatograms of standard solution and spiked sample solution(5 mg/L)

配制相同浓度的矿物质水、可乐和鲜橙多加标溶液，按照本方法分别重复进样6次进行测定，计算呋喃-2，5-二甲酸保留值的相对标准偏差(RSD)分别为0.61%，0.66%和0.18%，峰面积的RSD分别为0.57%，0.62%和0.98%，均符合定性(＜1.0%)与定量(＜3.0%)的重复性要求［15］，表明仪器具有良好的精密度。

2.5 回收率与精密度

采用空白样品加标法测定样品中呋喃-2，5-二甲酸的回收率。在矿物质水、可乐饮料和鲜橙多饮料空白样品中分别添加LOQ，2LOQ和10LOQ浓度的目标化合物，每个加标水平进行6次平行实验(见图2)。空白样品中呋喃-2，5-二甲酸的回收率为93.2%～109.0%，RSD为0.9%～4.2%，结果见表1，符合实验室质量控制要求［16］。

表1 空白样品中呋喃-2，5-二甲酸的加标回收率与相对标准偏差(n=6)Table 1 Recoveries and RSDs of furan-2，5-dicarboxylic acid spiked in blank samples(n=6)

2.6 稳定性考察

取相同浓度的标准溶液以及矿物质水、橙汁与可乐的加标溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h采用本方法进行测定，记录保留值和峰面积，计算得上述溶液的保留值RSD不超过0.6%，峰面积的RSD不超过1.0%，说明呋喃-2，5-二甲酸在24 h内稳定性良好。

2.7 干扰实验

饮料中一般含有机酸和食品添加剂，为考察这些化合物对呋喃-2，5-二甲酸测定的干扰情况，分别将有机酸(柠檬酸、苹果酸和酒石酸)、防腐剂(山梨酸、苯甲酸和脱氢乙酸)、甜味剂(乙酰胺磺酸钾和糖精钠)和人工合成着色剂(亮蓝、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、赤藓红和诱惑红)标准溶液加入到呋喃-2，5-二甲酸的标准溶液和加标混合样品溶液中，使其质量浓度均为5 mg/L，采用本方法对上述溶液进行测定。结果表明:在优化条件下，部分化合物在265 nm处无响应，部分化合物虽有响应，但与目标化合物的保留时间不一致，可与目标化合物达到基线分离(见图3)。因此上述化合物对本方法测定呋喃-2，5-二甲酸几乎无干扰［17］。

图3 干扰实验中呋喃-2，5-二甲酸的色谱图Fig.3 Chromatograms of furan-2，5-dicarboxylic acid in interference tests

2.8 实际样品的测定

在优化条件下，采用本方法测定了12份市售饮料(饮用水、果汁饮料和碳酸饮料)中呋喃-2，5-二甲酸的含量，采用保留时间和紫外光谱定性，辅以样品加标定性，外标法定量。结果均未检出呋喃-2，5-二甲酸(＜0.15 mg/kg)。

3 结论

本文建立了测定饮料中呋喃-2，5-二甲酸含量的高效液相色谱分析方法，采用亲水色谱柱Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)对目标化合物进行分析，二极管阵列检测器测定。该方法操作简便，线性范围宽，回收率高，完全能够满足饮料中呋喃-2，5-二甲酸的测定要求。

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