乙基化衍生/顶空气相色谱法快速测定葡萄酒中3种甲基锡

崔宗岩，周 乐，赵玉强，孙 扬，葛 娜，李阿丹，曹彦忠*

(1．秦皇岛出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，河北 秦皇岛 066004;2．燕山大学 环境与化学工程学院，河北 秦皇岛 066004)

有机锡是以Sn原子为中心，连接若干有机或无机基团而组成的化合物。作为一类重要的有机金属化合物，有机锡被广泛应用于船舶防污涂料、工业催化剂、农业杀虫和杀菌剂，以及聚氯乙烯(PVC)塑料的稳定剂等［1］。有机锡化合物具有广泛的毒性，其中三取代的有机锡化合物毒性最强，三丁基锡和三苯基锡是典型的内分泌干扰物，三甲基锡有较强的神经毒性［2］。近年研究表明，一甲基锡和二甲基锡暴露与生物体学习和记忆有关的行为模式损伤具有一定关联［3］。

有机锡化合物广泛存在于水和沉积物等环境介质［4］、工业品［5］和食品［6］中。葡萄酒在生产、加工及储存过程中，其原材料和容器设备可能受到有机锡的污染，导致有机锡化合物残留在葡萄酒中。近年来，随着人民生活水平的提高和保健意识的增强，葡萄酒的消费呈快速增长趋势，人们对葡萄酒的品质要求也逐渐提高。然而，葡萄酒中有机锡的污染状况及其对人体的健康风险尚缺乏系统研究。目前仅有少量文献报道了酒类饮料中有机锡化合物的分析方法，包括格氏试剂衍生/气相色谱法［7－8］、乙基化衍生结合液液萃取/气相色谱法［9］、固相微萃取结合气相色谱法［10－12］、分散液液微萃取结合气相色谱法［13］、固相微萃取结合气相色谱－质谱法［14］以及微波辅助萃取结合高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱法［15］等。然而，现有方法大多样品处理流程复杂，需要耗费大量的人力物力和较长的分析时间。针对甲基锡化合物分子量小、挥发性强的特点，本研究采用四乙基硼化钠进行原位乙基化衍生，建立了葡萄酒中3种甲基锡化合物快速检测的顶空气相色谱法。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Agilent 6890N型气相色谱仪，配置火焰光度检测器。气相色谱条件:DB－1701色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度250℃，分流进样，分流比为5∶1;载气为高纯氮气，恒流模式，流速为1.6 mL/min。升温程序为:初始温度40℃，保持1 min，以30℃/min升至250℃，保持2 min。火焰光度检测器温度为250℃，氢气与空气流速均为75 mL/min。

HSS 86.50型静态顶空自动进样器(DANI公司)，顶空实验条件:平衡炉温80℃，定量环温度90℃，传输线温度95℃，平衡时间45 min，振荡幅度为快速振荡，循环时间20 min，加压时间0.1 min，定量环填充时间0.1 min，进样时间0.3 min。

1.2 试剂与材料

有机锡标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，包括一甲基三氯化锡(98%，MMT)，二甲基二氯化锡(99.9%，DMT)，三甲基氯化锡(96%，TMT)。有机锡标准品储备液浓度均为1 g/L，以甲醇(色谱纯，迪马公司)配制，于－20℃冰箱中储存。工作液浓度为1 mg/L，采用超纯水进行逐级稀释获得，于4℃冰箱中储存，每周需重新配制。

衍生试剂四乙基硼化钠(NaBEt4，98%)购于美国CNW公司，其储备液以200 g/L配制于四氢呋喃(色谱纯，迪马公司)溶液中，置于冰箱中－20℃储存。工作液用超纯水稀释至终浓度为20 g/L，每工作日进行配制。储备液和工作液均储存在深棕色、密封良好的玻璃瓶中。冰乙酸(HAc，优级纯)购自天津市凯通化学试剂有限公司，无水乙酸钠(NaAc，分析纯)购自天津市风船化学试剂科技有限公司，以超纯水配成浓度为0.2 mol/L的HAc－NaAc缓冲溶液(pH 4.8)。

实验所用顶空瓶为钳口透明玻璃瓶，规格20 mL(23 mm×75 mm)，配硅橡胶/PTFE垫和瓶盖，均购自迪马公司。

1.3 实验方法

准确称取2.0 g葡萄酒样品置于顶空瓶中，加入8 mL pH 4.8的HAc－NaAc缓冲溶液，然后加入200 μL 2%NaBEt4，立即密闭瓶塞，置于顶空自动进样器，进行顶空萃取、进样、色谱分离和检测。

2 结果与讨论

2.1 气相色谱条件的优化

由于3种甲基锡的乙基化衍生产物分子量小，易挥发，因而气相色谱的保留时间较小，实验选取较低的初始温度(40℃)，以保证3种化合物在柱头实现良好的聚集，有利于后续程序升温分离。采用空白葡萄酒基质添加50.0 μg/kg的3种甲基锡化合物，在相同实验条件下对比了不分流，以及分流比为5∶1，10∶1和20∶1条件下目标物的分离及响应。实验结果表明，在不分流情况下，3种目标物的峰形展宽，分离效果较差;而分流比10∶1和20∶1时，目标物分离良好，但响应较低;分流比为5∶1时，3种目标物的分离效果良好，且响应最高(见图1)。因而，实验选定的分流比为5∶1。

2.2 顶空条件的优化

考察了温度对甲基锡化合物萃取的影响。结果表明，顶空温度对3种甲基锡存在不同程度的影响。当温度由50℃升至80℃时，三甲基锡的响应基本保持稳定，二甲基锡的响应缓慢增加，而一甲基锡的响应随之迅速增加(图2A)。当温度继续增至90℃时，3种甲基锡的响应保持不变或略有降低。综合上述结果，确定最佳顶空温度为80℃。

考察了萃取时间在5～60 min范围内时3种甲基锡的响应强度。结果显示，随着萃取时间的延长，3种甲基锡化合物的响应逐渐增大，在45 min时达到最高值，萃取时间继续增至60 min时，目标物响应保持不变或略有降低。因而，确定顶空时间为45 min。

图1 分流比5∶1条件下3种甲基锡化合物的分离和响应Fig.1 Separation and responses of three methyltin compounds under split modes with split ratio of 5∶1 concentration was 50.0 μg/kg for each analyte

对比了不振荡(No)、缓慢振荡(Soft)和快速振荡(Fast)对3种目标物响应的影响，结果表明，Fast方式下目标物的响应最高，因而实验选择快速振荡方式。

2.3 衍生条件的优化

衍生试剂对甲基锡的衍生至关重要。实验中，首先要保证衍生试剂足量，使目标物得以完全衍生;其次，由于NaBEt4母液配制于四氢呋喃溶剂中，过量的衍生试剂会使体系中有机溶剂含量增加，其进入顶空环境中会导致目标物的萃取效率降低。分别考察了衍生试剂(2%NaBEt4)加入量为20，50，100，200，500 μL时目标物的响应，结果显示，随着衍生试剂用量的增加，3种甲基锡化合物的响应逐渐增大，当衍生试剂加入量为200 μL时，3种甲基锡响应均达到或接近最高值，继续增加衍生试剂用量至500 μL，目标物响应无明显增加。因而，实验确定衍生试剂加入量为200 μL。

图2 温度(A)及pH值(B)对甲基锡化合物萃取的影响Fig.2 Temperature(A)and pH value(B)on extraction efficiencies of methyltin compounds

有机锡的乙基化衍生反应中，一般选用HAc－NaAc作为缓冲溶液，体系pH值为4.0～5.5之间［16］。本研究考察了pH值为3.0～5.5时3种有机锡的衍生效果。如图2B所示，随着pH值由3.0增加至4.8，目标物的响应逐渐增大，而当pH值继续增加至5.5，目标物的响应反而降低，因而选定4.8为最佳pH值。

通过向体系加入不同浓度的NaCl(0，1%，2%，5%，10%)考察了盐度对于甲基锡衍生和萃取的影响。结果显示，随着盐度增加3种甲基锡的响应均无明显变化。因此，实验采取不加盐的方式进行。

2.4 检出限与线性范围

采用基质外标工作曲线法进行定量，葡萄酒基质由若干空白样品混合获得。向其中添加系列标准溶液，使得样品中3种有机锡的含量分别为2.0，4.0，10.0，20.0，40.0，100.0，200.0 μg/kg。按照上述样品处理流程进行衍生和顶空气相色谱检测，获得基质匹配工作曲线。如表1所示，该方法在4.0～200.0 μg/kg范围内具有良好线性(r2≥0.994)。在葡萄酒基质中，以3倍信噪比(S/N=3)所对应的目标物浓度为其检出限(LOD)，得到3种甲基锡化合物的LOD为1.0～1.2 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)为3.3～4.0 μg/kg。

2.5 回收率与精密度

选取干白、干红和桃红3种代表性的空白葡萄酒基质，分别向其中添加5.0，10.0，100.0 μg/kg 3个浓度水平的3种甲基锡化合物进行检测。由表2结果可见，3种甲基锡的回收率为80.5%～101.4%，相对标准偏差(RSD)为3.2%～8.5%，说明方法具有较好的准确度和精密度。

表1 3种甲基锡化合物的线性方程、线性范围、相关系数(r2)、检出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 1 Linear equations，linear ranges，correlation coefficients(r2)，limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ)of three methyltin compounds

表2 3种甲基锡化合物的平均加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and relative standard deviations(RSD)of three methyltin compounds(n=6)

2.6 实际样品的检测

应用本方法对75个市售各类型葡萄酒样品进行检测，结果均未检出一甲基锡和三甲基锡，18个样品中检出微量二甲基锡，检出量为1.2～3.1 μg/kg。检测结果表明市售葡萄酒中甲基锡的含量较低，但其对人体的潜在健康风险仍需进一步研究。

3 结论

本文建立了同时检测葡萄酒中三甲基锡、二甲基锡和一甲基锡的乙基化衍生/顶空气相色谱－火焰光度检测法。方法具有操作简单、快速和不需要消耗剧毒有机溶剂的独特优点，且自动化程度高，单个样品的平均分析时间不超过25 min，极大地简化了操作，节约了分析时间，提高了检测效率。且具有良好的准确度和精密度，适用于葡萄酒中此3种甲基锡化合物的快速筛查检测。

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