邻苯二甲酸二丁酯对雄性小鼠生殖系统的脂质过氧化作用

吴冠宇，王 硕，刘 艳，赵淑华

（吉林大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学教研室，吉林 长春 130021）

邻苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是一种运用广泛的工业化学增塑剂，在受热、磨损等条件下，PAEs会与塑料逐步分离扩散到环境或生物体内［1－3］。PAEs的毒性远高于三聚氰胺，被列为主要的环境雌激素，是世界上最广泛存在的污染物［4－6］。作为PAEs中应用最为广泛的一种，邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）在土壤、大气和水体中均有检出［7］。其中，低相对分子质量的DBP多用于香水、化妆品等产品的生产加工；而高相对分子质量的DBP常添加于医疗器械、地板胶和墙面漆等产品中，用以增强材料的柔韧性［8－9］。我国已将 DBP确定为环境优先控制污染物［10］。有研究［11－14］表明：DBP 对雄性动物生殖和发育的影响包括精子生成障碍、睾酮合成量下降、胚胎畸形、睾丸标志酶活性下降和体质量减轻等，但其对生物体的干扰机制研究尚不充分。本实验选择小鼠为研究对象，通过检测雄性小鼠生殖系统抗氧化酶的活性，观察低剂量DBP对雄性小鼠生殖系统的脂质过氧化作用，探讨其对小鼠生殖系统毒性作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 健康雄性ICR小鼠40只，体质量（18±2）g，购自吉林大学基础医学院动物中心提供，动物合格证号：SYXK（吉）2007－0011，动物合格证号：SCXK（吉）2007－0003。小鼠于实验室适应性饲养3d后，随机分组分笼饲养，自由摄入食物和饮水，饲养温度18～24℃，相对湿度为50%～70%。DBP购自天津市光复精细化工研究所生产（纯度99.5%、相对密度1.0463～1.0475g·mL－1），食用玉米油购自中粮食品营销有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。TD5A台式自动平衡离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司），WS2－261－79型电热恒温水温箱（北京医疗设备厂），722型光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂制造），FA1004型上皿电子天平（上海天平仪器厂）。

1.2 动物分组和给药 将40只雄性ICR小鼠随机分为对照组和200、400、800mg·kg－1DBP组，每组10只。以玉米油溶解DBP，对照组小鼠灌胃给予玉米油溶剂，其他各组小鼠根据半数致死量（LD50）为8000mg·kg－1分别灌胃给予200、400和800mg·kg－1DBP，每天1次，连续给药2和4周，每天观察小鼠一般状况、饮食情况和活动情况、每天测量小鼠的体质量，根据体质量调整给药量［15］。

1.3 观察指标 分别于染毒后2和4周脱臼处死各组5只小鼠。取睾丸，称质量，去被膜，冰浴下匀浆，离心，取上清。计算小鼠睾丸质量与体质量比值，即睾丸的脏器系数。按照试剂盒说明书操作，测定各组小鼠睾丸组织中MDA水平和SOD、GSH－Px活性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析处理。各组小鼠睾丸组织中MDA水平和SOD、GSH－Px活性以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组小鼠体质量和脏器系数 染毒2周后，各染毒组小鼠体质量无明显变化（P＞0.05）；染毒4周后，800mg·kg－1DBP组小鼠体质量明显高于对照组和200mg·kg－1DBP组（P＜0.05）。染毒期间，小鼠体质量变化见表1。染毒2周后，各组小鼠睾丸脏器系数无明显变化（P＞0.05）；染毒4周后，400和800mg·kg－1DBP组小鼠睾丸脏器系数明显低于对照组和200mg·kg－1DBP组（P＜0.05）。见表2。

表1 各组小鼠体质量Tab.1 Body weights of mice in various groups（，m／g）

表1 各组小鼠体质量Tab.1 Body weights of mice in various groups（，m／g）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group.

Group Body weight（week）0 2 4 Control 22.19±1.3629.40±3.3232.70±3.32 DBP（mg·kg－1）200 23.25±1.2929.41±2.7832.34±3.07400 24.07±1.4530.90±2.1734.59±2.52800 23.74±1.6630.28±2.3635.71±2.39＊△

表2 各组小鼠睾丸脏器系数Tab.2 Testis organ coefficient of mice in various groups（n＝5，，η／%）

表2 各组小鼠睾丸脏器系数Tab.2 Testis organ coefficient of mice in various groups（n＝5，，η／%）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group.

Group Testis organ coefficient（week）2 4 Control 0.73±0.07 0.72±0.09 DBP（mg·kg－1）200 0.69±0.07 0.71±0.04400 0.73±0.11 0.62±0.07＊△800 0.64±0.02 0.60±0.05＊△

2.2 各组小鼠睾丸组织匀浆中MDA水平 染毒2周后，400和800mg·kg－1DBP组小鼠睾丸组织中MDA水平明显高于对照组和200mg·kg－1DBP组（P＜0.05）；200mg·kg－1DBP组MDA水平明显低于对照组（P＜0.05）。染毒4周后，200mg·kg－1DBP组MDA水平明显低于对照组（P＜0.05），400和800mg·kg－1DBP组MDA水平均明显高于对照组（P＜0.05），800mg·kg－1DBP组MDA水平明显高于200和400mg·kg－1DBP组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠睾丸组织匀浆中MDA水平Tab.3 MDA levels in testis tissue homogenate of mice in various groups ［n＝5，，mB／（mmol·g－1）prot］

表3 各组小鼠睾丸组织匀浆中MDA水平Tab.3 MDA levels in testis tissue homogenate of mice in various groups ［n＝5，，mB／（mmol·g－1）prot］

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group；#P＜0.05 vs 400mg·kg－1DBP group.

Group MDA level in testis homogenate（week）2 4 Control 0.77±0.08 1.25±0.15 DBP（mg·kg－1）200 0.69±0.06＊ 1.04±0.11＊400 0.95±0.08＊△ 1.43±0.12＊△800 1.12±0.07＊△# 1.80±0.13＊△#

2.3 各组小鼠睾丸组织匀浆中SOD活性 染毒2周后，200mg·kg－1DBP组SOD活性明显高于对照组（P＜0.05），800mg·kg－1DBP组SOD活性 明 显 低 于 对 照组（P＜0.05），400和800mg·kg－1DBP组SOD活性低于200mg·kg－1DBP组（P＜0.05）。染毒4周后，800mg·kg－1DBP组SOD活性明显低于对照组及200、400mg·kg－1DBP组（P＜0.05），其余各组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组小鼠睾丸组织匀浆中SOD和GSH－Px活性Tab.4 Activities of SOD and GSH－Px in testis tissue homogenate of mice in various groups［n＝5，，mB／（mmol·g－1）］

表4 各组小鼠睾丸组织匀浆中SOD和GSH－Px活性Tab.4 Activities of SOD and GSH－Px in testis tissue homogenate of mice in various groups［n＝5，，mB／（mmol·g－1）］

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group；#P＜0.05 vs 400mg·kg－1DBP group.

Group Activityof SOD（week）Activityof GSH－Px 2 4 Control 6.97±0.93 27.53±2.21 34.72±2.97 17.2 471±0.99 DBP（mg·kg－1）200 7.65±0.64＊ 26.84±2.64 18.26±1.05＊ 25.09±1.96＊400 6.21±0.40△ 25.91±2.67 19.74±1.86＊ 29.42±3.66＊△800 5.67±0.54＊△ 19.69±2.47＊△# 20.02±1.71＊ 24.66±1.38＊#

2.4 各组小鼠睾丸组织匀浆中GSH－Px活性 染毒2周后，各染毒组GSH－Px活性均明显低于对照组（P＜0.05），各染毒组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。染毒4周后，各染毒组GSH－Px活性均明显高于对照组（P＜0.05），且400mg·kg－1DBP组GSH－Px活性明显高于200和800mg·kg－1DBP组（P＜ 0.05）。见表4。

3 讨 论

氧自由基的堆积可使细胞膜发生脂质过氧化反应，产生大量的MDA。MDA作为脂质过氧化物的最终产物，其水平不仅反映出机体内自由基产生的多少，也反映出脂质过氧化的程度，并间接反映细胞受损伤的程度［16］。本实验中，400和800mg·kg－1DBP组MDA水平明显高于对照组，并且随着染毒时间、剂量增加，MDA水平明显升高，表明DBP可诱导小鼠睾丸内的脂质过氧化；而200mg·kg－1DBP组MDA水平较对照组明显下降，可能是DBP在诱导脂质过氧化的同时也启动了抗氧化系统，使机体处于代偿状态，也可能DBP抑制了体内的氧化还原过程。

正常情况下，机体所产生的自由基会迅速被体内酶系统清除，从而将自由基对机体的毒作用降至较低水平。机体中的抗氧化酶主要有SOD和GSH－Px。SOD为淬灭自由基的酶，并有终止自由基连锁反应，保护细胞的作用［17－18］。本研究结果显示：染毒2周时，各染毒组小鼠睾丸组织中SOD活性出现波动，4周时，800mg·kg－1DBP组SOD活性明显低于对照组及其他各染毒组。可能2周时DBP产生的过氧化自由基消耗了SOD；而4周时机体产生的酶的量和活性均明显上升，与对照组比较差异无统计学意义，但800mg·kg－1DBP组可能产生的脂质过氧化的量较多而使SOD明显消耗。

GSH－Px是机体主要的含巯基过氧化酶，其主要是以GSH为基质催化自由基的清除和过氧化物分解。在灭活大量产生的活性氧过程中，GSH－Px可能有过多的消耗而导致其活性下降。王玉邦等［19］在研究DBP对大鼠脂质过氧化的影响时发现：睾丸组织匀浆中GSH－Px在染毒2周后呈现上升趋势，800mg·kg－1DBP组与对照组比较差异有统计学意义，而在染毒4周后，各组间比较差异无统计学意义。在本实验中，染毒2周后，各染毒组GSH－Px活性均明显低于对照组；而染毒4周后，各染毒组GSH－Px活性均明显升高，与文献［19］报道的结果不同，这可能与体内的脂质过氧化作用对酶活性产生的干扰有关联，也表明DBP对生物体的脂质过氧化作用存在种属间的差异［20－21］，其机制有待进一步研究。

本实验中，各组小鼠体质量无明显差异，但染毒4周后，400和800mg·kg－1DBP组睾丸脏器系数明显下降，可能与睾丸组织的氧化损伤有关联。

综上所述，DBP可诱导小鼠睾丸产生脂质过氧化反应，诱导氧化应激，并干扰抗氧化酶的活性，最终可能造成生殖功能损伤。

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