镉对河南华溪蟹卵黄磷蛋白在卵巢中表达含量的影响及ELISA法的建立

杨 健 刘冬梅 何永吉 汉斯·达姆斯 王 兰



镉对河南华溪蟹卵黄磷蛋白在卵巢中表达含量的影响及ELISA法的建立

杨 健1刘冬梅2何永吉1汉斯·达姆斯3王 兰1

(1. 山西大学生命科学学院, 太原 030006; 2. 山西医科大学基础医学院, 太原 030006; 3. 高雄医学大学生命科学院, 高雄 80708)

为了探究镉对河南华溪蟹()的卵子发生的影响, 通过凝胶过滤层析法纯化了成熟卵巢中的卵黄磷蛋白(Vitellin, Vn), 采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定了Vn亚基数量及分子量, 以纯化的Vn为抗原制备了Vn多克隆抗血清并建立了可靠的Vn含量测定的ELISA方法。采用氯化镉体外亚慢性染毒的方法, 运用Vn-ELISA方法检测镉暴露对卵巢组织中Vn含量的影响。实验设对照组和5.8 mg/L镉处理组, 处理时间分别为10、15和20d。结果显示, (1) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明该蛋白由分子量为102、84和70 kD的3个亚基组成, 同时Western-blotting检测表明, 抗血清对该蛋白具有较强的免疫特异性; (2) 在Vn-ELISA中, Vn抗体最佳稀释倍数为1︰100000, 该方法的工作浓度范围为125—2000 ng/mL, 定性检测的灵敏度可达到15.62 ng/mL; 卵巢中Vn含量测定的结果中各批次间没有显著差异, 且平均变异系数分别仅为7.81%, 表示该法具有较高的稳定性和重复性; (3) 镉引起卵巢组织中Vn含量的显著降低, 与镉处理时间具有时间-效应关系, 说明了镉暴露可影响河南华溪蟹卵母细胞的成熟并对卵子发生产生抑制作用, 进而影响卵巢的正常发育。

河南华溪蟹; 卵黄磷蛋白; SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳; 酶联免疫吸附法; 镉

镉在工业中的大量使用导致其成为环境中大量存在的非必需金属元素之一, 同时也成为水体污染中一类典型的环境污染物。本实验室早期研究发现镉可以在河南华溪蟹()卵巢、肝胰腺、鳃以及肌肉等组织中富集, 导致生物体产生急性或慢性中毒, 造成组织器官出现不同程度的损害, 如镉诱导的细胞坏死、细胞凋亡和脂质过氧化反应[1—4]。韩托等[5]研究发现在镉富集的水域生物个体大量死亡, 这直接导致水生生物种群数量和生物多样性显著降低。此外, 研究发现镉会对鱼类、蟹类和鸟类的脂质、糖类和蛋白质代谢产生影响, 从而影响物种的迁徙和繁殖[6—8]。同时由于镉的半衰期较长, 通过消化及呼吸系统进入机体后造成的损伤是永久的, 这将会长期影响水生环境中物种的繁殖过程进而影响生物种群及生态系统, 因此探究可反映污染物对生物早期影响的繁殖参数是水生生态毒理学研究中急需要解决的问题。

卵子发生是甲壳动物卵巢发育中的一个重要阶段, 表现为卵母细胞中卵黄蛋白原(Vitellogenin, Vg)的形成和积累[9]。在卵巢中, Vg会通过进一步的修饰和加工形成包含有Vg、脂类、碳水化合物和色素等物质的卵黄磷蛋白(Vitellin, Vn), 并在卵母细胞中积累形成卵黄体。Vn是甲壳动物卵子存活和胚胎发育所需营养物质的主要来源, 卵巢中Vn积累的多少直接影响到其后生殖过程和幼体质量。因此, Vn可作为研究甲壳动物繁殖的重要生物指标[10]。此外, 甲壳动物的卵黄发生过程由于受内分泌系统、外部环境的调节而具有较高的复杂性, 目前对其内在的调控机制研究已成为甲壳动物研究热点和难点之一[11, 12]。甲壳动物Vn已有的研究发现, Vn含量与卵巢发育阶段具有一定的相关性, 因此机体组织中Vn含量测定对于研究镉对甲壳动物卵巢发育和卵子发生的影响具有重要意义。

酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunoabsor­bent assay, ELISA) 已被广泛用于甲壳动物Vn含量的测定[13, 14]。不同的甲壳动物在Vn亚基数目、空间结构和分子量上通常存在一定差异, 因此需要针对不同物种制备具有特异性的Vn抗体, 并在此基础上建立适合该物种Vn-ELISA方法, 为进一步研究甲壳动物卵黄发生及镉对卵巢发育的影响提供重要依据。目前, 对于甲壳动物卵子发生和镉对卵巢发育的影响已进行了较为广泛的研究[13—16]。然而河南华溪蟹在这方面的研究少有报道。因此, 当前迫切需要建立一种较为可靠的方法以测定镉处理后河南华溪蟹卵巢中Vn含量。本研究分离并纯化了河南华溪蟹的Vn, 制备了Vn多克隆抗体, 优化了Vn测定的ELISA参数, 该方法不仅可以用于研究镉对河南华溪蟹卵巢中卵子发生的影响, 还可作为深入研究河南华溪蟹生殖调控和环境监测的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

河南华溪蟹(简称“溪蟹”)于2013年10月购自山西省太原市五龙口水产批发市场。选取卵巢发育成熟的雌蟹置于实验室水族缸中暂养三周后进行活体解剖后将卵巢保存于–80℃冰箱中备用。

1.2 卵黄磷蛋白分离和纯化

卵巢粗提液的制备溪蟹成熟卵巢中加入10倍体积预冷的匀浆缓冲液(0.02 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl, 0.01% EDTA, 0.1 mmol/L PMSF)冰浴匀浆, 在4℃12000×下离心30min后取橘黄色上清液并加入等体积的饱和硫酸铵溶液, 冰浴1h后再次在4℃12000×下离心30min, 弃上清液, 向离心管中加入2 mL的PBS缓冲液(0.1 mol/L KH2PO4, 0.1 mol/L Na2HPO4·12H2O, 0.1 mol/L NaCl, 0.1 mol/L KCl, 0.01% EDTA, pH 7.7)溶解沉淀, 然后重复“沉淀-离心-复溶”的步骤5次, 最后将沉淀物溶解于1 mL PBS缓冲液中用于凝胶过滤层析分离纯化蛋白。

卵黄磷蛋白提取采用凝胶柱体积为260 mL (直径×高度=2.6 cm×100 cm, 上海厦美生物科技发展有限公司生产), 装入220 mL凝胶(型号SephacrylTMS 100 HR, 瑞典Pharmacia公司生产), 纯化前首先采用PBS缓冲液溶液平衡凝胶柱, 流速16 mL/h, 平衡1h。用注射器上样2 mL Vn提取液, 流速为16 mL/h, 使用UVD-680-3紫外检测器(上海金达生化仪器厂)在280 nm条件下检测洗脱液的吸收值。当出现蛋白组分时开始收集, 每2 mL收集1管, 洗脱液于–80℃保存备用。使用SpectraMax M5多功能酶标仪(美国Molecular Devices分子仪器公司)对提纯后的卵黄蛋白溶液进行连续光谱扫描(700—200 nm)以检测类胡萝卜素。

1.3 卵黄磷蛋白亚基数量及分子量分析

将纯化蛋白进行变性聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE, 分离胶质量浓度为10%, 浓缩胶质量浓度为5%), 然后用考马斯亮蓝R-250染色后, 在Tanon-2500 (上海天能公司)凝胶成像仪拍照, 通过与蛋白标准比对并采用BandScan 5.0软件以确定溪蟹Vn各亚基的分子量。

1.4 抗体制备和免疫印迹

选用6—8周龄雌性BALB/c小鼠作为免疫动物, 暂养1周后将纯化的Vn溶液与QuickAntibody等体积混合后用于免疫注射。每只小鼠于后腿小腿肌肉首次免疫注射100 μL (免疫抗原量25 μg)的抗原乳化液, 此后第21天再次注射100 μL抗原乳化液进行加强免疫, 第35天小鼠摘除眼球取血, 室温静置1h待血液凝固后, 于4℃12000×离心10min后取上清, 加入0.02% NaN3, 无菌分装于–80℃。

采用蛋白免疫印迹(Western-Blotting)检验抗体和抗原免疫反应的特异性。首先将纯化的Vn进行SDS-PAGE电泳, 电泳条件同前。电泳结束后的凝胶在72 V电压下转膜1h。将鼠多克隆抗体按 1︰5000稀释, 加样体积为1 mL, 室温孵育1h; 加入1︰2000稀释的羊抗鼠IgG-IRP(Catalog No. HSA0004, 上海麦约尔生物技术有限公司生产)作为二抗, 室温孵育1h后用1 mL PBST (10 mmol/L PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.2)洗涤3次, 每次10min; 采用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(德国Roche公司)显色3min后采用Tanon-2500凝胶成像仪拍照。

1.5 Vn抗体效价检测和Vn-ELISA建立

采用间接包被法ELISA确定鼠多克隆Vn抗体的有效稀释倍数并建立Vn-ELISA标准曲线。主要包括抗原包被、封闭、加抗体、显色、反应终止和读数等步骤。(1)包被: 将纯化的Vn用包被缓冲液(0.05 mol/L Na2CO3, 0.05 mol/L NaHCO3, pH=9. 6)溶解成1 μg/mL, 然后按每孔100 μL进行包被, 4℃过夜后去除包被液; (2)封闭: 用200 μL的PBST重复清洗3次后, 每孔加入200 μL的封闭液(1%牛血清白蛋白)封闭2h, 然后用PBST洗涤3次; (3)加抗体: 将纯化后的Vn抗血清按1︰1000、1︰10000、1︰100000和1︰20000用1%的BSA进行稀释, 每孔加样100 μL, 同时以不含Vn抗体的1% BSA为阴性对照, 37℃反应2h, 每孔用200 μL PBST洗涤3次后加100 μL稀释的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗, 37℃放置1h后用PBST洗涤3次; (4)显色: 加入100 μL TMB显色液(北京索莱宝科技有限公司), 室温避光放置30min; (5)反应终止: 加50 μL终止液(2 mol/L H2SO4溶液); (6)读数: 采用SpectraMax M5多功能酶标仪测定450 nm的吸光度。

在上述实验的基础上进行标准曲线制备, Vn稀释液的质量浓度分别为7.81、15.62、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000和4000 ng/mL, 每个质量浓度组各重复3孔, 同时设置3个阴性对照, 在酶标仪上读取450。根据线性关系和变异系数, 选取具有良好重复性和质量浓度相关性的Vn浓度范围绘制标准曲线。

1.6 验证性实验

随机选择5只雌性溪蟹, 分别称重0. 1 g左右的卵巢组织, 加入10倍体积预冷的匀浆缓冲液进行匀浆, 将匀浆液在4℃、12000×下离心15min, 取上清液0.1 mL用于ELISA测定。将匀浆液用包被缓冲液稀释后用于ELISA测定; 该实验重复进行3次, 然后分析批次间的误差及变异系数, 从而验证本实验建立ELISA方法的可靠性和稳定性。

1.7 样本染毒处理

选取处于卵巢发育期的成年雌性溪蟹进行染毒处理。实验设对照组和5.8 mg/L镉染毒组, 体外暴露10、15 和20d后取样。各染毒时间组随机选取5只溪蟹迅速解剖, 取出卵巢组织后采用Vn- ELISA法以测定其Vn含量。每个实验进行3次独立的重复。

1.8 数据分析

采用SPSS 17.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)对实验数据进行统计分析, 数据采用平均值±标准差表示。分别采用Kolmogorov-Smirnov和Levene法进行数据分布和方差齐性检验, 采用单因素方差分析中的Dunnett’s post-hoc 法对实验结果进行方差分析。采用Test (independent samples Test)比较不同Vn抗体稀释倍数、不同Vn质量浓度和不同测定批次对结果是否存在显著差异, LSD法进行染毒组与对照组两两比较, 以<0.05为差异显著标准。

2 结果

2.1 河南华溪蟹Vn的分离纯化和亚基组成

溪蟹卵巢匀浆液凝胶柱层析结果显示成熟卵巢匀浆液主要含有1个蛋白质峰, 洗脱时间在175—190min时该蛋白组分大量被洗脱出峰。由于甲壳动物卵黄磷蛋白含有较多类胡罗卜素, 连续光谱扫描的结果显示卵黄磷蛋白在470 nm处有明显的光吸收, 故该蛋白峰可能为溪蟹的Vn。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对该蛋白的进一步分析发现(图1), 该蛋白由3个亚基组成, 他们的分子量分别为102、84和70 kD。进一步通过WesternBlotting实验表明, 该蛋白及3个蛋白亚基均可与溪蟹Vn的多克隆抗体产生特异性免疫反应(图1)。

1. 标准蛋白; 2. 卵黄磷蛋白0.6 mg/mL; 3. 卵黄磷蛋白 0.8 mg/mL; 4. 卵黄磷蛋白Western-blotting

1. Molecular mass markers; 2. vitellin 0.6 mg/mL; 3. vitellin 0.8 mg/mL; 4. Vn Western-blotting

2.2 河南华溪蟹Vn抗体效价检测及标准曲线优化

由表1可见不同稀释倍数的溪蟹Vn抗体对ELISA读数的影响。抗体稀释1000—200000倍时,450读数均显著高于阴性对照且各浓度组差异显著。同时抗体稀释20万倍时,450读数与阴性对照呈显著性差异, 这说明该抗体具体较高的效价。由于抗体稀释10万倍时,450的差异系数仅为4.18%均低于各组, 因此本实验条件下的Vn抗血清最佳稀释倍数为1︰100000。在上述优化的Vn抗血清条件下, 将不同质量浓度的Vn包被液按样品直接包被法测定450值。

表1 河南华溪蟹Vn抗体不同稀释倍数的ELISA反应的A450值

注: 同列数据肩标含有不同上标字母为差异显著 (< 0.05);代表样品量, 下同

Note: Values within a column having different superscript letter are significantly different (< 0.05);means sample number. The same applies bellow

表2结果显示在Vn浓度在7.81—4000 ng/mL时,450值差异显著。由于Vn质量浓度为7.81 ng/mL时,450值与阴性对照相比不存在显著差异。而当Vn质量浓度为15. 62 ng/mL时,450值显著高于7.81 ng/mL浓度组和阴性对照, 因此该方法检测Vn可检出值为15. 62 ng/mL左右。

表2 不同Vn质量浓度的A450值

Vn质量浓度在7.81—62.5 ng/mL时,450的变异系数较大不符合标准曲线的要求, 且在4000 ng/mL与2000 ng/mL Vn浓度组相比,450值不存在显著差异, 因此选择Vn质量浓度为125、250、500、1000和2000 ng/mL制作标准曲线。图2结果表明在该范围内Vn质量浓度和450线性关系良好(= 0. 0008+ 0. 5565,2=0. 9763,< 0. 001,和分别代表Vn质量浓度和450), 且各点的变异系数较低, 因此该标准曲线的重复性和线性相关性均符合要求, Vn工作浓度范围为125—2000 ng/mL。

2.3 验证性试验

根据建立的Vn-ELISA标准曲线, 随机取5只雌性溪蟹的卵巢组织进行验证性试验并重复3次。表3为验证性试验的结果, 批次间平均变异系数仅为7. 81%。批次间测定的Vn含量无显著差异, 因此本实验建立的ELISA测定方法具有较高的稳定性和可重复性。

表3 河南华溪蟹卵巢中Vn的含量

2.4 镉对河南华溪蟹卵巢中Vn含量的影响

图3所示, 镉染毒后, 各处理组卵巢中Vn含量与对照组比较有显著性降低(< 0.05), 随着处理时间的延长, 卵巢中Vn含量呈现逐渐降低的趋势, 并在镉处理20d染毒组中达到最低值(31.42 ± 7.25) mg/g。

3 讨论

在大多数的甲壳动物中仅存在一种形式的卵黄磷蛋白[17, 18], 然而Serrano-Pinto等[19]和Laino等[20]的研究发现了两种存在形式的卵黄磷蛋白。在本研究中, 通过凝胶过滤层析法纯化了溪蟹成熟卵巢中的Vn。在经过SDS处理后发现该蛋白分成3条多肽链, 分子量分别为102、84和70 kD, 并且各亚基彼此差异明显, 这与其他甲壳动物的研究结果存在一定的差异。大量研究表明甲壳动物卵黄磷蛋白的分子量通常在200—700 kD, 且多由2—6个亚基组成, 如中华绒螯蟹()卵黄磷蛋白的分子量为520 kD, 两种亚基的分子量分别为97和74 kD[13]; 锈斑()Vn两个亚基分子量分别为105和76 kD[21]; 陆蟹() 3个亚基分子量分别为115、105和85 kD[22]; 日本沼虾() 3个亚基分子量分别为110、96和89 kD[23]; 三疣梭子蟹卵黄磷蛋白的亚基数为三个, 分子量分别为100、75和66 kD[14]; 克氏原螯虾()Vn分子量为481 kD, 有六个亚基 (198、176、132、111、92、82 kD)[24]。

以分离纯化后的溪蟹Vn为抗原, 制备了相应的Vn抗血清。Western-blotting实验表明该抗血清可以特异地识别溪蟹中的Vn。这种较高的特异性确保该抗体可用于溪蟹体内Vn的免疫学研究以建立一种Vn-ELISA法定量测定组织中的Vn的含量。当前的研究表明本文建立的Vn-ELISA法具有较高的灵敏度, 最低可检测到15.62 ng/mL的Vn, 其最佳的工作浓度范围为125—2000 ng/mL。而在其他甲壳动物中, 由Vn特异多抗血清建立的Vn-ELISA研究结果与本文的基本类似。Volz等[25]在对桡足类动物的研究中建立Vn-ELISA工作范围为31—1000 ng/mL, 精度为1.9 ng/mL。在中华绒螯蟹的研究中, Chen等建立了一个类似的Vn-ELISA, 其测定范围为8—500 ng/mL[13]。牡蛎()Vn-ELISA系统中的工作浓度为 10—400 ng/mL[26]。验证性实验结果显示出本实验所建立的河南华溪蟹Vn-ELISA法在批次内和批次间不存在显著性差异, 同时具有较低的差异系数, 因此该法具有较高的稳定性和可重复性。与当前已经发表的研究结果比较, 本实验所建立的Vn-ELISA工作范围是可信和敏感的。该法所具有的较高的精确度使得可以在不同时间直接进行样本间卵黄磷蛋白含量的比较。为了使该法可以应用与不同卵黄磷蛋白浓度的测定, 本文将纯化好的卵黄磷蛋白稀释为不同的浓度以建立一条标准曲线, 这样可以定量测定在经过镉处理后溪蟹组织中的卵黄磷蛋白。本实验结果发现, 在经过镉的亚慢性染毒处理之后, 溪蟹卵巢中的Vn含量显著降低, 这表明镉暴露可抑制溪蟹中Vn的合成和积累。本实验室早期研究发现镉处理后溪蟹卵巢指数显著降低, 并认为这可能是溪蟹体内存储的大量能量物质被分解以用于能量合成的结果[27]。Vn作为溪蟹卵巢中重要的营养物质, 它的减少则可能是导致卵巢发育异常的重要原因。Revathi等和Rodriguez等研究认为镉对Vn合成的抑制作用可导致卵巢中卵母细胞直径减小, 这可延缓卵母细胞的成熟和卵子的发生, 进而影响卵巢的正常发育和种群的繁殖[28, 29]。

在大部分的昆虫中, 卵黄磷蛋白在卵巢外先合成为卵黄磷蛋白的前体蛋白, 然后通过血液循环系统输送到卵巢, 然后被卵母细胞吸收。当前关于甲壳动物卵黄蛋白原的合成位点还没有搞清楚, 一直都是研究的热点。关于十足类甲壳动物Vg合成部位的研究结果显示, 肝胰腺和卵巢是公认的主要的合成部位, 其次是血细胞和皮下脂肪体, 因此在甲壳动物中Vg的合成可能是内源的或外源的或两者兼有。在一些种类中, Vg在卵巢中合成, 如短沟对虾()[30]。而在另一些甲壳动物种类中, Vg在肝胰腺中合成, 如一种溪蟹()[31]。对于不同种甲壳动物, Vg合成部位的研究结果不尽相同。当前关于河南华溪蟹卵黄磷蛋白的研究较少, 因此, 可以在本文研究的基础上, 进一步探讨河南华溪蟹卵黄发生部位和镉对Vn合成影响的机理。

致谢:感谢邹恩民教授对论文的修改给予的指导帮助。

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ESTABLISHED OF ELISA METHOD OF VITELLIN FROM FRESHWATER CRAB () AND EFFECT OF CADMIUM ON VITELLIN ACCUMULATION IN OVARY

Yang Jian1, Liu Dong-mei2, He Yong-ji1, Hans-Uwe Dahms3and Wang Lan1

(1. School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. School of Basic Medical,Shanxi Medical University, Taiyuan 030006, China; 3. School of Life Science, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung 80708,Taiwan, China)

To explore the effect of cadmium (Cd) on oogenesis of freshwater crab (), vitellin (Vn) and the method of Vn-ELISA was studied and established. Vn was purified from mature ovaries ofby gel filtration chromatography. Using SDS- polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the molecular weight and the quantity of Vn subunit were determined. Based on the purified Vn and Vn anti-serum, the reaction parameters for an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed. To explore the effect of cadmium on the Vn in the ovaries, freshwater crab.weretreated with 5.8 mg/L Cd for 10, 15, and 20d. The results showed that Vn was composed of three subunits (116, 66 and 45 kD). Western-blotting confirmed the polypeptides had a specific reactivity with mouse polyclonal Vn anti-serum. The optimal dilution rates of Vn anti-serum were shown to be 1︰100000. According to these optimal parameters, the standard linear equation was established for the determination of Vn concentration with a valid range of 125—2000 ng/mL, and qualitative detection can be 15.62 ng/mL. In verification experiments, Vn content in the ovaries showed no significant differences, and the mean coefficients of variation of inter-assay were 7.81%, suggesting that the developed ELISA of this study was precise, stable and repeatable. Moreover, Cd caused a time-dependend down-regulation of Vn level, and showed significant effects of Cd on vitellogenesis, which suggest that Cd slows down oocyte maturation and vitellogenesis in

; Vitellin; SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; Enzyme-linked immunosorbent assay; Cadmium

10.7541/2015.38

X174

A

1000-3207(2015)02-0287-07

2014-09-04;

2014-12-07

国家自然科学基金(No. 30870267, No. 30970361); 山西省回国留学人员科研项目(No. 2010015); 山西省普通高校特色重点学科建设项目(No. 2011-SXDX-SWX-003)资助

杨健(1988—), 男, 山西长治人; 博士; 主要从事环境重金属污染研究方向。E-mail: yangjian333001@126.com

王兰(1960—), 女, 山西太原人; 教授; 主要从事典型重金属污染的细胞与分子机制研究方向。E-mail: lanwang@sxu.edu.cn