高温胁迫对皱纹盘鲍幼鲍免疫因子的影响

贾艳丽，王江勇，孙敬锋

（1.中国水产科学院 南海水产研究所，广东 广州510300；2.广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州510300；3.天津农学院 水产科学系，天津300384）

鲍（Abalone）的分类地位属于软体动物门、腹足纲、前鳃亚纲、原始腹足目、鲍科、鲍属［1］，赋有“海产八珍”之一的美誉，鲍自古便是餐桌上的上等菜肴，除去可食用部位，其外壳亦可入药，具有很高的营养和药学价值。在中国，鲍的养殖主要分布在大连、山东、福建、广东、海南、广西等沿海地区，主要养殖种类为北方沿海的皱纹盘鲍（HaliotisdicushannaiIno）以及南方沿海的杂色鲍（HaliotisdiversicolorReeve）［2］，2011年的产量居世界第一，中国已成为世界第一养鲍大国［3－4］。

然而由于大规模生产导致的环境恶化、近交严重、种质退化以及病害频发［5－9］等问题，严重影响了鲍产业的发展。作为鲍的主产区，南方海域杂色鲍不明原因的大规模死亡给鲍产业带来了巨大的经济损失［10－11］，科研工作者尝试将北方的皱纹盘鲍引进南方养殖，在一定程度上缓解了这种压力，然而皱纹盘鲍高温季节的死亡率不容忽略，因此进一步提高皱纹盘鲍的耐高温性能是科研工作者的研究方向。贾艳丽等①贾艳丽，王江勇，刘广锋，等.高温胁迫对皱纹潘鲍幼鲍生长和存活的影响.南方水产科学，2014接收已经筛选出具有一定抗逆性能的皱纹盘鲍杂交鲍，通过高温胁迫试验得出该鲍耐受温度可超过30℃，该试验从生理学角度探索其耐高温性能，期望能够为培育出抗逆性强的新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

试验时间为2013年11月中旬至2013年12月末，选取生长健康壳长接近10mm的皱纹盘鲍360只，平均放置于15个尺寸为50cm×30cm×40cm的玻璃水缸中，玻璃缸内放置鲍砖以供鲍附着并有一定的遮光作用。试验共分4组，每组3个平行，每个平行30只鲍，试验开始时选取壳长相近的幼鲍进行实验，经测量并进行数据分析后可知各组鲍的平均壳长为11±0.50mm，平均壳宽8±0.50mm，湿质量为0.2±0.05g，均值、标准差和组间的差异性详见表1。

表1 各组鲍试验开始时的规格Table 1 Size of each group at the beginning of the research

1.2 日常管理

每个水缸接通一个充气石保证溶氧不低于5mg·L－1。试验期间每天下午投喂适量鲍配合饲料，次日早晨采用虹吸法从底部清除残饵和粪便，并添加经过滤及预热至所需温度的新鲜海水，依据试验设计记录死亡情况，通过控制加热棒的温度来调节试验组温度，温差范围控制在±0.5℃以内。

1.3 试验方法

将上述15个玻璃水缸平均分为4组，每组3个平行，其中一组为对照组，水温维持自然水温（实验开始时温度为22℃，在20～23℃变化），其他4组利用加热棒（JEBO佳宝）采用温度渐变（30℃以下每3d升温1℃，30℃以上每周升温1℃）的方式分别升温至25，28和31℃。当温度升至预定温度并维持一周后采样，每个平行取3只鲍，－80℃保存，由于鲍个体小，不能取出足够血淋巴进行免疫因子的测定，该试验所取样本为鲍的肌肉组织。免疫因子（碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM））和组织中总蛋白含量（BCA）的具体测定方法见南京建成生物工程研究所研制的试剂盒使用说明，每个平行取3只鲍，分别测定每只鲍上述几种免疫因子的活性。对各实验组进行温度控制时，用加热棒对水体进行加热，其他环境条件一致，在对结果进行分析时可以忽略其他因素的影响。

1.4 数据处理

按照所购买试剂盒说明书的公式计算各种酶的活性，并绘制温度－酶活性柱形图，应用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 高温胁迫对皱纹盘鲍幼鲍SOD活性的影响

水温由22℃升到25℃时，皱纹盘鲍幼鲍体内SOD活性升高3倍，差异显著（P＜0.05，图1）；当水温升至28℃时，SOD活性在25℃的基础上升高近2倍，同样有显著差异（P＜0.05，图1）；然而，当温度由28℃升至31℃时，SOD的活性变化不显著（P＞0.05，图1）。

图1 各试验组皱纹盘鲍幼鲍体内SOD活性Fig.1 SOD activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

2.2 高温胁迫对皱纹盘鲍幼鲍AKP活性的影响

水温由22℃升至25℃时，AKP的活性升高（P＞0.05，图2）；水温由25℃升至28℃时，AKP活性显著升高（P＜0.05，图2）；水温由28℃升至31℃时，AKP活性不再上升，出现下降的趋势（P＞0.05，图2）。

图2 各试验组皱纹盘鲍幼鲍体内AKP活性Fig.2 AKP activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

2.3 高温胁迫对皱纹盘鲍幼鲍ACP活性的影响

水温由22℃升至25℃时，ACP的活性上升（P＞0.05，图3）；水温由25℃升至28℃时，ACP活性显著升高（P＜0.05，图3）；水温由28℃升至31℃时，ACP活性显著升高（P＜0.05，图3）。

图3 各试验组皱纹盘鲍幼鲍体内ACP活性Fig.3 ACP activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

2.4 高温胁迫对皱纹盘鲍幼鲍LZM活性的影响

水温由22℃升至25℃时，LZM的活性升高（P＞0.05，图4）；水温由25℃升至28℃时，LZM活性显著升高（P＜0.05，图4）；水温由28℃升至31℃时，LZM活性出现显著下降的趋势（P＜0.05，图4）。

图4 各试验组皱纹盘鲍幼鲍体内LZM活性Fig.4 LZM activity of young Haliotis discus hannai Ino in test groups

3 讨论

非特异性免疫是生物与生俱来的保护屏障，对外界刺激有直接并迅速的反应，因此非特异性免疫因子的变化情况能够反映出生物体在外界刺激下的机体状况，下面分别阐述在高温胁迫下鲍几种非特异性免疫因子的变化情况。

3.1 高温胁迫对鲍肌肉组织中SOD活性的影响

SOD是参与防御抗氧化的关键酶之一，当生物机体受到外界刺激时会不同程度的影响SOD的活性，短期轻度的逆境胁迫会使SOD活性升高来消除这种胁迫造成的损伤，长期重度逆境胁迫往往会使SOD活性降低从而使机体受到伤害［12］。温度升高会使机体产生过多的活性氧，此时就需要SOD来催化过氧阳离子的歧化反应，消除自由基造成的伤害［13－15］。该试验采用温度渐变的方式对皱纹盘鲍幼鲍进行温度胁迫，当温度由22℃升高至28℃时SOD的活性显著升高，这与上述理论相符，而当温度由28℃升高至31℃时，SOD活性没有显著变化，这可能是因为SOD活性已经升高到机体所能调控的最高值，如果温度继续升高可能会对机体造成伤害，就该实验而言，皱纹盘鲍幼鲍对31℃这一温度存在耐受性。温度骤变条件下三疣梭子蟹［15］SOD活性变化以及温度骤变对南美白对虾［16］抗氧化系统的影响与该温度渐变条件下皱纹盘鲍幼鲍SOD活性变化有异曲同工的效果，时少坤［17］研究的水温胁迫对杂交鲍免疫因子的影响中，6，12，24℃组SOD活性与对照组18℃组无显著差异，30℃组SOD活性显著降低，而该实验中31℃组SOD的活性仍处于较高水平，根据两种鲍在高温下SOD活性大小的差异可以推测该实验所选皱纹盘鲍幼鲍比时少坤的研究中所选杂交鲍能够耐受更高的温度。

3.2 高温胁迫对鲍肌肉组织中磷酸酶AKP、ACP活性的影响

磷酸酶是生物机体重要的代谢调控酶类，参与磷酸基团的代谢和转移，同时也是溶酶体的重要组成部分，当机体受到外来物质入侵时，能够及时参与物质的转运来破坏或消除外来物质的侵害，达到防御的作用［18－19］。随着温度由22℃升高到28℃，AKP和ACP活性均通过不同程度的升高来调控机体适应这种外界条件的改变。在31℃条件下，ACP活性继续升高而AKP活性没有继续升高，这可能是机体对两种酶的调控存在一定的差异，也可推测31℃下的ACP或AKP活性已达到或接近机体承受的上限，温度再高的话会引起机体损伤。这与时少坤［17］研究的温度渐变下ACP活性无显著变化，但30℃下活性显著下降结果类似，也可支持该实验的推测。同理，温度骤变会引起ACP、AKP活性显著变化这一现象也在吴丹华等［15］、李强等［19］对三疣梭子蟹免疫因子的影响研究中得到证实。

3.3 高温胁迫对鲍肌肉组织中LZM活性的影响

溶菌酶是一种水解酶，可以减轻机体内毒素带来的伤害，可以增强机体免疫力，在非特异性免疫中也发挥重要作用，其活性大小受到温度、pH和化学物质等的影响［20］。温度对水生动物的影响至关重要，机体溶菌酶活力的大小直接反映了水生动物的免疫状况，因此机体LZM活力的大小是衡量该温度是否适宜生物生存的重要指标［21］。该实验中随着温度由22℃升高到28℃，机体通过调节LZM活性的升高提高了免疫状况来度过这种外界胁迫，时少坤［17］的研究中高温下（30℃）皱纹盘鲍LZM活性显著下降，同样也有研究证实水温升高会使黑唇鲍［22］、近江牡蛎［23］、栉孔扇贝［24］、菲律宾蛤仔［25］LZM 活性下降，在31 ℃ 条件下LZM活性相对于28℃有显著下降的趋势，但仍高于对照组22℃下的活性，说明该种幼鲍可以耐受31℃的高温，但活性有所下降说明机体在过高温度下会出现免疫下降的状况。

本实验通过几种非特异性免疫因子的变化情况对所选皱纹盘鲍幼鲍的耐温性进行了初步分析，实验结果为进行下一步的筛选工作提供了很好的基础，项目组将对28℃以上高温中仍然存活下来的皱纹盘鲍幼鲍继续进行选育，选出更具耐高温潜力的品系，并进一步研究鲍体内非特异性免疫因子在受外界刺激后的变化和对机体的保护机制，然而热休克转录因子的信号转导已经在线虫中展开了研究［26］，在后续的试验中将选取不同地区选育的皱纹盘鲍幼鲍进行对比，结合其在高温条件下的生长、死亡情况、体内的生理生化反应［27］和温度骤变条件下热休克蛋白的表达情况对比分析不同来源鲍对高温的耐受性，试图探寻其耐热机理，为抗逆杂交鲍的选育提供依据。

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