丹参、黄芪注射液对自体脂肪移植存活率的影响

李鹏飞 郑丹宁 周 佳 王 健 张波朱 昌余力

丹参、黄芪注射液对自体脂肪移植存活率的影响

李鹏飞 郑丹宁 周 佳 王 健 张波朱 昌余力

目的观察中药丹参、黄芪注射液对自体脂肪移植成活率的影响，为后续实验及临床应用提供依据。方法建立新西兰白兔自体脂肪移植动物模型，实验组分别予以腹腔注射丹参、黄芪注射液，于不同时间点采血、取材，测定血清VEGF表达水平和脂肪存活率，HE染色观察组织细胞形态，血小板-内皮细胞黏附分子CD31、周脂素免疫组化染色观察毛细血管密度及细胞活性。结果自体脂肪移植术后第12周，实验组脂肪存活率显著高于对照组；各时间点实验组血清VEGF表达水平均显著高于对照组；HE、CD31、周脂素染色示，实验组在细胞形态、新生毛细血管密度及细胞活性方面均明显优于对照组。结论配合应用丹参、黄芪注射液，能够显著提高新西兰白兔自体脂肪移植的存活率。

丹参注射液黄芪注射液自体脂肪移植存活率

自体脂肪具有取材简便、来源丰富、充盈外观好、组织相容性好等优点[1-5]，临床上被用于修复因软组织缺损引起的各种先天性和后天性畸形。然而自体脂肪移植颇高的吸收率却使得其临床应用受到限制。研究表明，提高自体脂肪移植细胞的存活能力，早期重建移植组织的血供，对于自体脂肪移植的存活具有重要意义[6]。

丹参又名赤参，是最常用的活血化瘀中药之一，具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神之功效[7]。现代药理学研究表明，丹参常用于治疗心血管系统疾病，具有改善微循环、促进血管新生、抗肿瘤、抗肝纤维化、预防应激性溃疡、调节免疫、抗菌消炎等作用[8-11]。黄芪是最常用的益气中药之一，具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿的功效[12]。现代药理学认为，黄芪对心血管、循环、物质代谢、肝肾功能及肿瘤等均可发挥良好的治疗作用[13-14]。黄芪具有显著的抗氧化活性，能够抑制自由基的产生，并且能够有效清除机体内过剩的自由基，使得细胞减轻或免受自由基产生的过度氧化作用，保护线粒体的结构和功能，从而起到保护细胞、延长细胞寿命的作用[15]。本实验建立新西兰白兔自体脂肪移植动物模型，观察比较丹参、黄芪注射液对自体脂肪移植中对细胞保护、血运重建、毛细血管新生及成活率的影响，为进一步实验和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、材料

丹参注射液、黄芪注射液（正大青春宝）；ELISA试剂盒（R&D公司，美国）；鼠单克隆抗CD31因子抗体（Abcam公司，英国）；鼠抗免疫组化试剂盒（欣博盛公司）；羊抗人多克隆抗周脂素抗体（Bio-Sciences公司，英国）；生物素标记兔抗山羊IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；碱性磷酸酶（Sigma-Aldrich公司，美国）；BCIP/NBT显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及分组

健康新西兰白兔12只（我院动物实验中心提供），雌雄不限，体质量2.7±0.3 K g。随机分成3组：对照组4只，行自体脂肪移植术+腹腔注射生理盐水；实验组1（丹参组）4只，行自体脂肪移植术+腹腔注射丹参注射液2.5 g/K g·d；实验组2（黄芪组）4只，行自体脂肪移植术+腹腔注射黄芪注射液2.5 g/Kg·d。术前1周至术后3周用药，持续4周。

1.2.2 自体脂肪移植动物模型

图1术中暴露新西兰白兔肩胛区脂肪组织并游离Fig.1 The adipose tissue was exposed and dissociated in the New Zealand white rabbit's scapular area

图2 将移植脂肪组织注射入兔耳背部皮下Fig.2 Autologous adipose tissue was injected into the dorsum of the ears subcutaneously

动物术前禁食12 h。全麻后，备皮，俯卧位固定于清洁手术台上，背部肩胛区正中线距颈部约5 cm处作5 cm长切口，垂直切开皮肤及皮下组织，显露附着于背阔肌筋膜浅层的脂肪垫（图1），取出脂肪组织约4～5 m L。转移到PBS溶液中，冲洗，剪碎，获得直径约1～2 mm的脂肪颗粒。消毒耳背部皮肤，将脂肪颗粒置入2 m L注射器，以12号注射针头分别注入双耳背部皮下4个部位，每次0.6～0.7 m L（图2）。

1.2.3 标本采集与检测

分别于术中、术后1、2、4、6、8周在兔后腿外侧表浅静脉取血，每只取血1～2 m L，取上层血清，酶联免疫吸附法（ELISA）检测VEGF表达水平。术后第2、4、12周取材，于移植体周边切开皮肤，沿被膜仔细分离，完整取下脂肪移植体，分离修去周围组织及包膜，精密称重，与术前记录对比计算存活率。4%多聚甲醛固定标本24 h，石蜡包埋切片，行HE染色及血小板-内皮细胞黏附分子CD31、周脂素免疫组化染色。HE染色后，以囊和空泡、纤维化、结缔组织以及淋巴和巨噬细胞浸润的炎症反应等作为指标，按严重程度将组织形态划分为0到5级：0级，重度弥漫性分布；1级，中到重度弥漫；2级，中度分布；3级，轻到中度分布；4级，偶然出现；5级，无出现[16]。

1.2.4 统计学分析

使用SPSS13.0软件进行处理，计量资料采用t检验或单因素方差分析，存活率比较采用卡方检验，等级资料采用Kruskal Wallis检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自体脂肪移植组织大体观察

移植术后取材，存活良好的移植体表现为质地柔软、边界清晰、活动度好的组织团块，呈暗黄色，外部被一层纤维组织包膜所包裹，界线较明显（图3）。

2.2 存活率的比较

移植术后第2、4周，对照组与各实验组存活率无显著性差异（P＞0.05）；术后第12周，各实验组存活率均明显高于对照组（P＜0.05）；实验组间未见统计学差异（P＞0.05）。丹参组存活率最高，黄芪组次之，对照组最低（图4）。

图3 脂肪组织移植体体积对比（左起：对照组、黄芪组、丹参组）Fig.3 The volume com parison among representative grafts in different groups.The sequence from the left:control group, astragalus propinquus group and salvia m iltiorrhiza group

图4 移植术后各组脂肪移植体存活率比较Fig.4 The survival rates of grafts of three groups after transplantation

2.3 血清VEGF的表达水平

实验组VEGF表达水平在移植术的当天及术后1、2、4、6、8周与对照组比较均有明显增高（P＜0.05）；黄芪组在各时间点表达水平较丹参组稍高，但差别无统计学意义（P＞0.05）（图5）。

图5 各组血清VEGF表达水平比较Fig.5 The expression levels of VEGF in serum in each group

2.4 组织学观察

图6 术后第2、4、12周，各组HE染色观察（200×）Fig.6 Histological observation by HE staining 2,4,12 weeks after transplantation(200×)

HE染色显示，丹参组的脂肪细胞存活最好，形态上较完整，脂滴大小一致，血液供应较充裕；黄芪组的存活情况尚好，细胞的完整度稍差，有更多的结缔组织隔膜和炎性浸润，却有更丰富的新生血管；对照组存活情况最差，有很多大而不规则的空泡及较严重的组织纤维化（图6）。

2.5 血小板-内皮细胞黏附分子CD31免疫组化染色

对照组脂肪组织中血运不丰富，新生血管不明显。实验组移植体组织中血管较丰富，又以周边区域更多。实验组中又以黄芪组新生血管数量更多，较多分布于细胞间的结缔组织内；丹参组新生血管数量较少，散在分布于细胞周边岛状结缔组织中（图7）。

图7 各组CD31免疫组化染色（200×）Fig.7 The expression of platelet endothelial cell adhesion molecule-1(CD31)in each group by immune-histochem istry (200×)

2.6 周脂素免疫组化染色

对照组移植体组织中染成晶蓝色的脂肪细胞少，多位于移植体的边缘，表明脂肪细胞活性较差；实验组有活性的脂肪细胞相对多，又以丹参组更多。丹参组有活性的脂肪细胞较多，脂肪细胞边缘染成完整的晶蓝色，存活较好；黄芪组有部分活性脂肪细胞，呈浅蓝色，细胞活性相对较差（图8）。

图8 各组周脂素免疫组化染色（200×）Fig.8 The expression of perilipin in each group by immune-histochemistry(200×)

3 讨论

自体脂肪移植已广泛应用于以美容和重建为目的软组织充填中[17]。但移植后较高的吸收率导致治疗效果存在不确定性，成为自体脂肪移植进一步发展的障碍，也是近年来研究的重点和难点[18-19]。

促进脂肪细胞增殖分化、加快移植组织的血供重建是提高存活率的关键因素。随着分子生物学、细胞生物学的发展，在各种因子应用于提高脂肪移植存活率的研究中，除VEGF外，尚有诸如b-FGF、前列腺素E1、瘦素（Leptin）、EGF、富血小板血浆（Platelet-Rich Plasma，PRP）、ANG-1、PDGF等，均可不同程度地促进移植脂肪组织的存活[20-26]。然而，这些因子大多价格昂贵，半衰期短，临床效果个体差异较大。尽管目前已有相当数量的基础和临床研究初步验证了应用生长因子的有效性，但我们对生长因子仍然存在着质疑，担忧其可能带来的不良反应及并发症，这种担忧主要是一些肿瘤组织中存在着生长因子或相关基因的高表达，或是某些生长因子本身就是癌基因的产物[27-28]。临床应用生长因子是否能导致过度表达，甚至诱发肿瘤，仍然是值得特别关注的问题。

近来，中药的相关研究也开展得越来越深入，许多药理作用得到了较广泛的认同。在中医理论中，丹参是最常用的活血化瘀的药物之一。据现代药理学的研究，丹参的水溶性成分具有很强的清除自由基和抗脂质过氧化作用[29-30]。其有效成分可用于治疗心血管疾病，且对内皮细胞还有保护作用。此外，丹参还能提高红细胞的变形能力，改善微循环障碍，有促进血管新生、抗肿瘤、抗肝纤维化、预防应激性溃疡、调节免疫、抗菌消炎等作用[8-11]。鉴于自体脂肪移植对血供的需求，我们通过引入丹参来探讨和观察其对自体脂肪移植的影响。

黄芪常与丹参搭配使用，是最常用的益气中药之一。具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿之功[12]。现代药理学研究表明，黄芪对心血管、循环、物质代谢、肝肾功能及肿瘤治疗等疾病均可发挥良好的治疗作用[13-14]。黄芪具有显著的抗氧化活性，能够对自由基的产生起到抑制作用，并能有效清除机体内过剩的自由基，使得细胞减轻或免受自由基产生的过度氧化作用，保护线粒体的结构和功能，从而起到保护细胞、延长细胞寿命的作用[15]。研究显示，黄芪确有提高自体脂肪移植存活率的作用[31]。鉴于黄芪保护细胞、延长细胞寿命和丹参改善微循环的作用，我们通过丹参、黄芪对自体脂肪移植的作用来比较两者对自体脂肪移植的影响，希望能为将来的临床应用提供实验依据。

本实验结果显示，自体脂肪移植术后第12周，两实验组的存活率明显高于对照组，有统计学差异。提示应用丹参、黄芪注射液有助于提高自体脂肪移植成活率。可能移植体血管新生和血运重建是一个相对缓慢的过程，在早期（第2、4周）诱导足量新生血管形成之前，各组之间的差异不明显。

血清VEGF结果显示，丹参、黄芪组的表达水平在移植术的当天及术后第1、2、4、6、8周与对照组比较均有明显增高，推测中药制剂在移植术后的早期发挥了扩张小动脉和改善微循环的作用，同时上调了VEGF的表达。实验组在VEGF的作用下诱导毛细血管新生，以增加移植组织所需的血供。

血管内皮细胞因子CD31免疫组化法染色结果显示，对照组移植脂肪组织中血运不丰富，新生血管少。中药组移植体组织中新生血管较丰富，又以周边区域更多。中药组中又以黄芪组新生血管数量较多。周脂素免疫组化法染色结果显示，中药处理的两实验组相对对照组有活性的脂肪细胞分布更广泛、数量更多，其中又以丹参组活性高、数量多。

结合HE、CD31和周脂素的染色结果，通过丹参、黄芪组间的比较可以发现，丹参组在细胞形态上最好，而血管数量不是最丰富，多分布在细胞周边的岛状结缔组织中；黄芪组的细胞形态不是最好，但血供却较为丰富，血管多数分布在细胞间增生的结缔组织内，丰富的血供可能并未能在脂肪细胞的成活上发挥重要作用。因此我们推测，丹参和黄芪在细胞保护、抗氧化和诱导血管新生、血运重建方面均发挥了较为重要的作用。就本实验结果而言，丹参可能在细胞保护方面作用略佳，在上调VEGF水平和血管新生方面两种中药效果相仿。

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The Effects of Salvia m iltiorrhiza and Astragalus propinquus In jection on the Survival of Autologous Adipose Tissue Transplantation

LI Pengfei,ZHENG Danning,ZHOU Jia,WANG Jian,ZHANG Bo,ZHU Chang,YU Li.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:YU Li(E-mail:yuoli@163.com).

Objective To explore the effects of Salvia miltiorrhiza and Astragalus propinquus injection on the survival of transplanted grafts,so as to provide evidence for further research and clinical application.M ethods Autologous adipose tissue transplantation model was established using New Zealand white rabbit.The experimental groups were given S. miltiorrhiza and A.propinquus injection intraperitoneally.The expression levels of VEGF in serum and survival rates were measured and calculated at different time points.Tissue morphology was observed by HE staining.The expression of platelet endothelial cell adhesion molecule-1(CD31)and perilipin were observed by immune-histochemistry to evaluate the neocapillary growth and cyto-activity of transplanted adipose tissue.Results Twelve weeks after transplantation,the survival rates in experimental groups were higher than the control group.The expression levels of VEGF in serum in experimental groups were significantly higher than those in the control group at each time point.HE and immuno-histochemical staining demonstrated better morphology,denser neo-capillaries and higher cyto-activity in experimental groups,compared with the control group.Conclusion By applying S.miltiorrhiza and A.propinquus injection,the survival of autologous transplanted adipose tissue can be significantly enhanced in New Zealand rabbits.

Salvia miltiorrhiza injection;Astragalus propinquus injection;Autologous adipose tissue transplantation; Survival rate

R622+.9

A

1673－0364（2015）03－0144－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.03.007

2015年3月17日；

2015年4月26日）

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

余力（E-mail：yuoli@163.com）。