SICT与ELISA法在奶牛结核病检测中的应用试验

段志涛，庄君英(宁波市镇海区畜牧兽医总站，浙江宁波315202)

SICT与ELISA法在奶牛结核病检测中的应用试验

段志涛，庄君英
(宁波市镇海区畜牧兽医总站，浙江宁波315202)

为准确评估宁波市镇海区奶牛结核病检测中阳性牛的感染率，对现存奶牛养殖场的184头奶牛，分别采用SICT与ELISA检测方法进行检测，对这两种方法的检出率、符合率进行比较分析。经试验，SICT与ELISA两种检测方法奶牛结核病阳性牛的检出率分别为1.63%(3/184)和0.54%(1/184)，且SICT法的阳性检测率高于ELISA法，两种检测方法的阳性符合率为33.3%(1/3)。

结核病;变态反应试验;酶联免疫吸附试验;奶牛

牛结核病是由牛分枝杆菌和结核分枝杆菌引起的一种人畜共患慢性传染病，呈世界性分布，在我国被列为二类动物疫病。结核病的广泛传播与蔓延，对人畜健康和畜牧业的发展带来了严重危害。我国是世界上结核病感染最重的22个国家之一［1］。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，结核病的感染率为44.5%［2］。部分研究人员认为，肺结核病人中约有15%的结核病患者是因饮用结核病牛的牛奶而发病的［3］。

目前，我国对奶牛结核病的检测主要采用牛型分枝杆菌提纯蛋白衍生物(PPD)进行单纯颈部皮内变态反应试验(SICT)，对检出的阳性牛进行隔离或淘汰。但该方法存在较高的非特异性，在结核病流行地区采用该法进行牛群普检，则有利于感染牛的早期检出。但在结核病控制或稳定地区，采用该法则不利于结核病净化。

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法在奶牛结核病检测中则具有方便、快速、高通量、特异性强等特点，其检测机理有别于SICT法。

本试验采用SICT与ELISA相结合的方法，现将试验结果报告如下，供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验在宁波市镇海区某奶牛场进行，检测奶牛184头。

牛分枝杆菌ELISA抗体检测试剂盒由武汉某生物制品有限公司生产，结核菌素由哈尔滨某生物疫苗有限公司生产。

1.2 SICT试验

1.2.1 术前处理 颈侧中部上1/3处剪毛，3月龄内犊牛，也可在肩胛部进行，直径约10 cm，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，做好记录。

1.2.2 检测方法 75%酒精消毒术部，不论大小牛只，一律皮内注射牛型提纯结核菌素1万国际单位。即将牛型提纯结核菌素稀释成每mL含10万国际单位后，皮内注射0.1 mL。冻干菌素应当天稀释后当天用完。

1.2.3 结果判定 注射后72 h，仔细观察牛颈侧注射部位局部有无热痛、肿胀等炎性反应，若注射部位局部有明显炎症反应，皮皱厚度增加4 mm及以上者，判为阳性;若注射部位局部炎症反应不明显，皮皱厚度增加2～4 mm者，判为可疑;注射部位局部无炎症反应，皮皱厚度增加2 mm以下者，判为阴性。可疑牛经42 d后重复上述试验，结果仍为可疑及以上者，直接判为阳性，否则判定为阴性。

1.3 ELISA试验

1.3.1 待检血清 待检牛尾静脉无菌采血5 mL，45°倾斜4℃过夜，离心采集血清，备用。

1.3.2 检测方法

1.3.2.1 配液 将20倍浓缩洗涤液用去离子水作20倍稀释后备用。

1.3.2.2 编号 将样品与对应微孔按序编号，每板设阴、阳性对照各2孔。

1.3.2.3 加样 将待检血清在血清稀释板中按1∶100稀释，对照血清在血清稀释板中按1∶10稀释，取抗原包被板，每孔加入100μL稀释样品。轻轻振匀孔中样品，置37℃下温育30 min。

1.3.2.4 洗涤 甩去板孔中溶液，每孔加入稀释洗涤液200μL，静置1 min后倒弃，用吸水纸拍干，重复洗涤5次。每孔加入羊抗牛酶标二抗100μL，置37℃下温育30 min，洗涤5次。

1.3.2.5 显色 每孔加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，混匀，置室温(20～25℃)下避光显色10 min。

1.3.2.6 终止 每孔加入终止液50μL，10 min内测定结果。

1.3.3 结果判定 酶标仪测定各孔OD630nm值。试验成立条件，阳性对照OD630nm值均≥0.70，阴性对照OD630nm值均<0.31。计算S/P=(样品OD630nm-阴性对照OD630nm平均值)/(阳性对照OD630nm平均值-阴性对照OD630nm平均值)，如S/P≥0.17，判为阳性;S/P<0.17，判为阴性。

2 结果与分析

184头奶牛同时应用SICT法和ELISA法进行检测，结果见表1。

表1 SICT法和ELISA法检测(单位:头)

由表1可见，SICT法检出阳性牛3头，阴性牛181头，阳性检出率为1.63%(3/184);ELISA法检出阳性牛 1头，阴性牛 183头，阳性检出率为0.54%(1/184)。两种检测方法的检测结果表明，该牛场结核病感染率较低，且SICT法的阳性检出率高于ELISA法，两法之间的阳性符合数为1头，阳性符合率为33.33%(1/3)。

两种检测方法，如果以SICT法作为金标准，3头阳性牛中，ELISA法的阳性符合数为1头，其敏感性为33.33%(1/3);181头阴性牛中，ELISA法试验检出的阴性牛为181头，其特异性为100%(181/ 181)。如果以ELISA法作为金标准，ELISA法183头阴性牛中，SICT法检出的阴性牛为181头，其特异性为98.91%(181/183)。

经本次试验检测，表明两种方法均具有同等良好特异性，但敏感性SICT法优于ELISA法。

3 小结与讨论

一般情况下，我国奶牛结核病检测大都采用结核分枝杆菌对结核菌素产生一种迟发性变态反应，进行单纯牛型PPD试验作为结核病的检测标准，这种方法并不十分理想。一是不同厂家生产的PPD产品本身存在质量差异;二是SICT检测方法存在较高的非特异性，很多物理性、化学性或生物性因素可能影响检测结果，如牛白血病病毒、副结核杆菌、禽型分枝杆菌或非结核分枝杆菌等微生物感染都可导致假阳性结果［4］。

宁波市镇海区地处沿海，属经济发达地区，对奶牛结核病防控十分重视，奶牛结核病的发病率较低。单纯应用SICT法检测，较高的非特异性将可能淘汰许多非结核阳性牛，给养殖户带来较大经济损失。因此，在保持传统的SICT法检测的同时，有条件的地区应逐步引进采用ELISA检测法。

SICT法主要检测细胞免疫，ELISA则主要检测体液免疫。当结核分枝杆菌感染动物时，动物机体对结核分枝杆菌的免疫首先是细胞免疫，其次才是体液免疫［5］。对ELISA法检测的阳性牛，不论其变态反应为阳性或阴性，都应认为是活动性结核，应一律淘汰;SICT法检测为阳性而ELISA法检测为阴性者，一般为结核初期、封闭期或非特异反应，应进行隔离饲养或淘汰，并定期加强ELISA检测。将两种方法有机结合，才能达到有效净化与控制奶牛结核病的目的。

［1］World Health Organization.Global tuberculosis control: key findings from the December 2009 WHO report［J］. Wkly Epidermal Rec，2010，85(9):69-80.

［2］全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告［J］.中华结核和呼吸杂志，2002，25(1):3-7.

［3］徐广贤，赵德明.牛分枝杆菌与肺结核分枝杆菌基因组的比较［J］.现代生物医学进展，2006，6(7):67-69.

［4］林世平，杨应周，谭卫国，等.牛鼻腔分泌物非结核分枝杆菌分离培养物结果分析［J］.中国热带医学，2005，5 (6):1207-1209.

［5］Emmerzaal A，Deleu S.Cattle tuberculosis by Mycobacterium bovine is difficult to detect and to treat ［J］.Veehouderen Diercnarts，2000，14(2):427.

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2014-08-20