枸杞多糖通过诱导巨噬细胞极化抗胰腺癌的研究

杨青，白光，王巍，包翠芬，翟振华

枸杞多糖通过诱导巨噬细胞极化抗胰腺癌的研究

杨青1，白光2△，王巍2，包翠芬1，翟振华2

目的探讨枸杞多糖（LBP）通过诱导巨噬细胞极化成一型巨噬细胞（M1）抗小鼠胰腺癌细胞LTPA的功效。方法构建小鼠CB-17SCID皮下LTPA成瘤模型，随机分为荷瘤模型组（10只）及LBP治疗组（10只），LBP治疗组每日10 mg/kg LBP灌胃，荷瘤模型组每日同等剂量的生理盐水灌胃。将含有相同数量的小鼠巨噬细胞Raw264.7随机分为不同LBP浓度的实验组和对照组，MTT法检测各实验组与对照组中Raw264.7的光密度（OD）值；ELISA法检测LBP质量浓度为100 mg/L的实验组与对照组中Raw264.7分泌白细胞介素（IL）-12及IL-10的水平；流式细胞仪检测LBP质量浓度为100 mg/L的实验组与对照组中Raw264.7表面蛋白CD16/32及CD206的水平。小鼠荷瘤3周后剖瘤称质量并计算瘤体体积，检测LBP对皮下肿瘤生长的影响，HE染色和KI-67免疫组化法检测LBP对瘤组织镜下的改变及对LTPA增殖的影响。结果100 mg/L LBP对Raw264.7的生长有明显促进作用（P＜0.01），并使Raw264.7高表达CD16/32，低表达CD206；高分泌IL-12、低分泌IL-10。LBP治疗组瘤块质量、体积及KI-67的表达量显著低于荷瘤模型组（P＜0.01），镜下肿瘤坏死区范围明显大于荷瘤模型组。结论LBP能够通过诱导巨噬细胞极化成M1状态达到抗LTPA的作用。

巨噬细胞；胰腺肿瘤；枸杞多糖；巨噬细胞极化；抗胰腺癌；1型巨噬细胞；2型巨噬细胞

胰腺癌是我国主要的恶性肿瘤之一［1］，具有起病隐匿、手术切除率低、放化疗不敏感、病死率高、预后差的特点。因此，亟待寻求一种新的、放化疗不良反应小、较高效的治疗药物。枸杞多糖（lycium bar⁃barum polysaccharide，LBP）是枸杞中重要的有效成分，具有调节免疫、抗肿瘤等作用［2］。虽已有文献报道LBP具有多种免疫调节作用［3］，且能够对抗多种肿瘤的生长［4］，但对巨噬细胞Raw264.7极化影响的研究及抗胰腺癌的作用报道尚少。本实验通过检测LBP作用于Raw264.7后细胞数量及其极化水平的变化，以及体内LBP抗小鼠胰腺癌细胞LTPA的研究，旨在探讨LBP在体内抗LTPA的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂LBP购自上海康州真菌多糖有限公司（检验批号：KZ20130916），呈棕黄色粉末，可溶于水。小鼠白细胞介素（IL）-12、IL-10 ELISA试剂盒购自美国R&D公司。PerCP标记的小鼠CD16/32抗体，FITC标记的小鼠CD206抗体均购自Bio Legend公司。抗体KI-67蛋白、PV6001试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DMEM、RPMI-1640培养基、新生小牛血清购自Gibco、四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司。其他实验试剂均由辽宁医学院附属第一医院肿瘤中心实验室提供。

1.1.2 细胞株与实验动物小鼠胰腺癌细胞株LTPA购自上海拜力生物公司。小鼠巨噬细胞Raw264.7购自北京鼎国生物科技有限公司。健康SPF级CB-17SCID小鼠20只，雌雄各半，5周龄，体质量16～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司［许可证号：SCXK（京）2014-0004］。

1.1.3 主要仪器及设备超净工作台（苏州净化设备厂），高速冷冻离心机（Sigma公司），流式细胞仪（BD FACS Verse），酶标仪（Bio-Rad美国），光学显微镜、石蜡切片机（Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及给药将处于对数生长期的LTPA调成1×107个/mL的单细胞悬液，75%乙醇消毒小鼠左腋窝下1 cm处皮肤并于该处皮下种于0.2 mL细胞悬液。随即将20只小鼠按随机数字表法分为荷瘤模型组和LBP治疗组，每组10只。接种24 h后LBP治疗组每天以10 mg/kg［2］LBP的剂量灌胃0.5 mL，荷瘤模型组则每日灌胃0.5 mL生理盐水，连续21 d，第22天处死小鼠后实验。

1.2.2 MTT法检测LBP对Raw264.7生长的影响取对数生长期的Raw264.7，用DMEM完全培养液将细胞调成2× 105/mL悬液，向96孔板中加入细胞悬液100 μL/孔，待细胞附壁，弃去上清液后随机分为实验组和对照组，向实验孔顺次加入过滤无菌的LBP质量浓度为10、50、80、100、150、200 mg/L的DMEM完全培养液100 μL，构成不同LBP质量浓度的实验组，向对照孔加入相同体积的DMEM完全培养液，构成

对照组。每个剂量设置4个复孔。常规培养48 h后加入10 μL的MTT溶液（5 g/L），重置培养箱培养4 h后，加入150 μL DMSO，震荡10 min，于490 nm波长处测取光密度（OD）值。

1.2.3 LBP对Raw264.7分泌及表面蛋白的影响将Raw264.7接种到6孔板后（1×106个/孔），随机分为实验组及对照组，待细胞附壁后，弃去上清液，实验组加入含100 mg/L LBP的DMEM完全培养液，对照组加入同等体积的DMEM完全培养液，常规培养48 h。（1）48 h后，取2组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定IL-10及IL-12含量。（2）48 h后，收集2组贴壁细胞，经预冷PBS洗涤，2%多聚甲醛室温固定，PBS复洗后调整每组细胞数为1×106个/流式管，加入相应荧光标记抗体，室温避光孵育，用含1%血清的PBS洗涤后流式细胞仪检测表面蛋白的变化。

1.2.4 LBP对皮下肿瘤生长的影响将小鼠颈椎脱臼处死，钝性分离皮下肿瘤，用生理盐水洗净瘤块，滤纸吸干后称取瘤质量，游标卡尺测算体积，计算抑瘤率。瘤块体积=1/2×瘤块长径A（mm）×瘤块横径B（2mm）。抑瘤率（%）=（［模型对照组平均瘤质量-LBP治疗组平均瘤质量）/模型对照组平均瘤质量］×100%。

1.2.5 瘤块组织病理学检查切取部分瘤块组织，用体积分数为4%的多聚甲醛固定过夜，常规石蜡包埋后行HE染色。

1.2.6 免疫组化法检测瘤块中KI-67的表达切取LBP治疗组、荷瘤模型组瘤块，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片机切片（5 μm），二甲苯脱蜡，高压加热修复抗原，过氧化氢（H2O2）封闭及PBS冲洗后于每张切片中滴加适当比例稀释的KI-67抗体，经4℃孵育过夜后，滴加适量二抗，最后行DAB显色，镜下控制反应时间，自来水终止显色，苏木素复染，乙醇梯度脱水后封片、固定。用已知的阳性标本作为阳性对照，PBS替代一抗作为阴性对照。采用CIAS图像分析系统检测阳性蛋白表达的平均灰度。

1.3 统计学方法实验数据用SPSS 13.0软件包进行统计分析，各指标用表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组之间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LBP对Raw264.7生长的影响经不同浓度的LBP作用48 h后，各实验孔Raw264.7数量较对照组均有所提升，但100 mg/L LBP组细胞数量较对照组差异明显（n=5，F=3.073，P＜0.05）。见图1、2。

Fig.1The influence of different concentrations of LBP in the growth of Raw264.7图1 不同质量浓度LBP对Raw264.7生长的影响

Fig.2The influence of 100 mg/L LBP in the growth of Raw264.7图2 100 mg/L LBP对Raw264.7生长的影响

2.2 LBP对Raw264.7分泌IL-12及IL-10的影响经100 mg/L LBP作用48 h后的Raw264.7较对照组能够显著提高IL-12水平［（83.00±4.01）μg/L vs（50.06±6.74）μg/L，t=9.420，P＜0.01］，但IL-10的分泌水平较对照组显著下降［（407.13±12.02）μg/L vs（633.67±19.09）μg/L，t=22.456，P＜0.01］。

2.3 LBP对Raw264.7表面蛋白CD16/32及CD206表达的影响经100 mg/L的LBP作用48 h后的Raw264.7较对照组高表达CD16/32，而较低表达CD206，见图3。

Fig.3The influence of LBP in surface proteins of Raw264.7图3 LBP对Raw264.7表面蛋白的影响

2.4 LBP对皮下肿瘤生长的作用LBP治疗组皮下瘤体质量及体积明显小于荷瘤模型组［（1.14± 0.23）g vs（2.06±0.19）g，t=9.871，P＜0.01；（181.50± 13.05）mm3vs（386.10±14.09）mm3，t=33.680，P＜0.01］，LBP抑瘤率为44.7%，见图4。

Fig.4The influence of LBP in subcutaneous tumor growth图4 LBP对皮下肿瘤生长的影响

2.5 瘤块组织病理学检查荷瘤模型组肿瘤细胞密度较大，排列紧密，增长旺盛，异型性明显。LBP治疗组肿瘤细胞密度不同程度的减小，肿瘤坏死程度较荷瘤模型组亦较明显，同时部分区域可见淋巴细胞、单核细胞浸润及纤维组织增生。见图5。

2.6 LBP对肿瘤组织中KI-67表达的影响KI-67

蛋白主要表达于细胞核，呈棕黄色颗粒。荷瘤模型组肿瘤组织中KI-67的阳性细胞较多，表达率为60%；LBP治疗组KI-67的阳性细胞明显减少，表达率为20%。见图6。

3 讨论

3.1 LBP对Raw264.7的作用本研究显示，当质量浓度为100 mg/L的LBP于体外作用于Raw264.7细胞48 h后，Raw264.7的细胞数量显著多于对照组，表明LBP具有促进Raw264.7分裂增殖的作用。研究表明巨噬细胞按照其表型及分泌的细胞因子可分为经经典途径激活的巨噬细胞（M1）和经替代途径激活的巨噬细胞（M2）［5-6］。具有特异性表面蛋白标志物CD16/32的M1［7-8］，抗原呈递能力强，能够分泌大量的IL-12［9］。IL-12能够在介导Th1免疫效应中发挥作用，从而刺激辅助T细胞的增殖，发挥抗炎抗肿瘤的作用［10-11］。而具有特异性表面蛋白标志物CD206的M2［7-8］，抗原提呈能力弱，能够分泌大量的IL-10［9］。IL-10能抑制单核细胞主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ依赖的抗原提呈、Th1免疫效应细胞因子的合成和T淋巴细胞的合成，造成Th1细胞及其细胞因子比例减少，常导致肿瘤细胞免疫逃逸，致使肿瘤发生［11-12］。巨噬细胞在特定的组织环境下可处于M1和M2的任一中间阶段，而巨噬细胞向M1及M2分化的过程称为极化（polarization），该极化过程具有可逆性及可调节性［13］。本研究显示，当质量浓度为100 mg/L的LBP作用于Raw264.7细胞48 h后，Raw264.7表面蛋白CD16/32的表达量及IL-12的分泌水平较对照组明显增加，而CD206的表达量及IL-10的分泌水平较对照组则明显降低，表明LBP能够促进巨噬细胞由M2的极化状态向M1的极化状态转变，进而有助于促进巨噬细胞发挥抗炎及抗肿瘤的作用。

3.2 LBP对皮下LTPA的影响研究表明LBP具有调节免疫及抗肿瘤的作用。本实验显示，给予皮下荷LTPA的小鼠以10 mg/（kg·d）的剂量连续灌胃LBP 21 d后，可见皮下瘤块的体积及质量较荷瘤模型组明显变小；与荷瘤模型组广泛的肿瘤坏死区比较，肿瘤细胞的密度也明显降低；KI-67染色后阳性细胞的数量也较荷瘤模型组显著减少。表明经LBP灌胃治疗后，LTPA的增殖受到了明显的抑制，肿瘤区坏死范围明显增加，起到了抗肿瘤生长的作用。

综上所述，LBP不仅能够提升巨噬细胞Raw264.7的数量，而且能够调定其极化状态，从而使M1的数量增加，增强了机体的免疫活性，从而达到抗肿瘤生长的作用。LBP通过巨噬细胞的极化达到抗肿瘤的效用可能成为LBP治疗肿瘤的一个新靶点而逐步受到重视。

（图5、6见插页）

［1］Chen WQ，Zheng RS，Zeng HM，et al.Report of cancer incidence and mortality in China，2011［J］.China Cancer，2015，24（1）:1-10.［陈万青，郑荣寿，曾红梅，等.2011年中国恶性肿瘤发病和死亡分析［J］.中国肿瘤，2015，24（1）:1-10］.doi:10.11735/j.issn.1004-0242.2015.01.A001.

［2］Gan L，Hua ZS，Liang YX，et al.Immunomodulation and antitumor activity by a polysaccharide-protein complex from lycium barbarum［J］.Int Immunopharmacol，2004，4（4）:563-569.

［3］Wang J，Hu Y，Wang D，et al.Sulfated modification can enhance the immune-enhancingactivityoflyciumbarbarumpolysaccharides［J］.Cell Immunol，2010，253（2）:219-223.doi:10.1016/j.cellimm.2010.04.001.

［4］Guo PP.A Survey of studies on anti-tumor effects of LBP and its mechanisms［J］.Journal of Beijing Union University（Natural Sciences），2011，25（4）:26-29.［郭培培.枸杞多糖的抗肿瘤作用及其机理研究现状［J］.北京联合大学学报（自然科学版），2011，25（4）:26-29］.

［5］Gordon S，Taylor PR.Monocyte and macrophage heterogeneity［J］. Nat Rev Immunol，2005，5（12）:953-964.doi:10.1038/nri1733.

［6］Gordon S.Alternative activation of macrophages［J］.Nat Rev Immu⁃nol，2003，3（1）:23-25.doi:10.1038/nri978.

［7］Liang YB，Wang ZH，Tang H，et al.Diverse expression patterns of microRNA-155 between bone marrow-derived M1 and M2 macro⁃phages［J］.Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2012，10（16）:1866-1870.［梁艳冰，王中华，唐晧，等.微小RNA-155在小鼠骨髓来源M1和M2巨噬细胞中表达的差异［J］.中国组织工程研究，2012，10（16）:1866-1870］.

［8］Raes G，Noel W，Beschin A，et al.FIZZ1 and Ym as tools to dis⁃criminate between differentially activated macrophages［J］.Dev Im⁃munol，2002，9（3）:151-159.doi:10.1080/1044667031000137629.

［9］Zhang F，Xiong SD.The polarization of macrophages and its significance［J］.Chinese Journal of Cell Biology，2007，29（1）:27-30.［张凤，熊思东.巨噬细胞的极化及其意义［J］.细胞生物学杂志，2007，29（1）:27-30］.

［10］Chen JJ，Lin YC，Yao PL，et al.Tumor-associated macrophages:the double-edged sword in cancer progression［J］.J Clin Oncol，2005，23（5）:953-964.

［11］Sun P，Wang YL.Tumor-associated Macrophages Deverlopment and Treatment of Tumor［J］.Cancer Res Prev Treat，2014，41（7）: 829-833.［孙鹏，王艳林.肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤发展及治疗中的作用［J］.肿瘤防治研究，2014，41（7）:829-833］.doi:10.3971/j. issn.1000-8578.2014.07.031.

［12］Fridman WH，Pages F，Sautes-Fridman C，et al.The immune con⁃texture in human tumours:impact on clinical outcome［J］.Nat Rev Cancer，2012，12（4）:298-306.doi:10.1038/nrc3245.

［13］Gordon S，Martinez FO.Alternative activation of macrophages: mechanism and functions［J］.Immunity，2010，32（5）:593-604.doi: 10.1016/j.immuni.2010.05.007.

（2015-3-20收稿 2015-07-06修回）

（本文编辑 李鹏）

Anti-tumor effects of lycium barbarum polysaccharide on pancreatic cancer cells by polarization of macrophages

YANG Qing1，BAI Guang2△，WANG Wei2，BAO Cuifen1，ZHAI Zhenhua2
1 Department of Human Anatomy&Histology and Embryology，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China；2 The First Affiliated Hospital，Liaoning Medical College△

ObjectiveTo explore the effects of lycium barbarum polysaccharide（LBP）on restraining the mouse pancre⁃atic cancer cells LTPA by the polarization of macrophages to type 1 macrophages（M1）.MethodsLTPA tumor model of the subcutaneous CB-17SCID mice was constructed.Model mice were randomly divided into tumor-bearing model group（n=10）and LBP treatment group（n=10）.The LBP treatment group was fed 10mg/kg LBP every day，and the tumor-bearing model group was fed the same dose of normal saline.The same amount of macrophages Raw264.7 was randomly divided into the control group and experimental groups（different concentrations of LBP）.MTT assay was used to detect the optical density（OD）of Raw264.7 in experimental groups and control group.ELISA was used to detect the levels of the interleukin（IL）-12 and IL-10 in experimental group（LBP was 100 mg/L）and the control group.Flow cytometry was used to test the levels of the membrane protein CD16/32 and CD206 in experimental group（LBP was 100 mg/L）and the control group.The tumor mass was weighted and the volume was calculated after three weeks.The effects of LBP on the growth of subcutaneous tumor were detected.HE staining and KI-67 staining were used to detect the microscopic changes of tumor and the proliferation of the LTPA.ResultsThe dose of 100 mg/L LBP can promote the growth of the macrophages Raw264.7（P＜0.01），and induced the high expression of CD16/32 and low expression of CD206，high secretion of IL-12 and low secretion of IL-10.The weight，volume of the tumor and the expression of KI-67 were significantly lower in experimental group than those in the con⁃trol group（P＜0.01）.The microscopic necrosis area range of tumor was larger than that of control group.ConclusionThe LBP has the effect of restraining LTPA by the polarization of macrophages to M1.

macrophages；pancreatic neoplasms；lycium barbarum polysaccharide；the polarization of macrophages；an⁃ti-tumor about pancreatic cells；type 1 macrophages；type 2 macrophages

R285.5；R735.9

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.018

吴阶平医学基金项目（320.6750.1281）；辽宁省工业企业科技特派员行动项目

1辽宁锦州，辽宁医学院人体解剖与组织胚胎学教研室（邮编121000）；2辽宁医学院附属第一医院

杨青（1988），男，硕士研究生在读，住院医师，主要从事肝胆外科肿瘤方面的研究

△通讯作者E-mail：blueskydavid@163.com