牛奶β-乳球蛋白质实时荧光定量PCR检测方法的建立

贾敏，张银志，张亦凡，孙秀兰*，

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡 214122；3.汉中市产品质量监督检验所，陕西汉中 723000）

牛奶β-乳球蛋白质实时荧光定量PCR检测方法的建立

贾敏1，张银志2，张亦凡3，孙秀兰*1，2

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡 214122；3.汉中市产品质量监督检验所，陕西汉中 723000）

建立一种快速、特异、灵敏的Taqman实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法，用于牛奶主要过敏原β-乳球蛋白质的检测。根据GenBank登录的牛β-乳球蛋白质的DNA序列设计，合成一对特异性引物和探针。将扩增产物连接到pMD19-T载体上，制备质粒标准品并测序鉴定，10倍梯度稀释含有β-乳球蛋白质基因的重组质粒，进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线，检测该方法的特异性、稳定性、灵敏性，同时将建立的方法用于10种市售食品的检测。成功建立了β-乳球蛋白质的实时荧光定量PCR检测方法，标准曲线的Ct值与模板浓度在3.18× 103～3.18×107copies范围内线性关系良好，R2值为0.997 8；检测灵敏度高（318 copies/μL）；特异性强，对羊奶、豆浆DNA均无扩增反应；稳定性好，组内、组间的变异系数均在5%以内。对10种食品牛奶过敏原的检测结果与标签相符。表明所建立的实时荧光定量PCR方法可应用于食品中牛奶过敏原β-乳球蛋白质的检测并可推广到其它过敏原的检测。

牛奶过敏原质；β-乳球蛋白质；Taqman实时荧光定量PCR法；检测

牛乳及乳制品是常见的八大食物过敏原之一，牛乳过敏（CMA）是由于摄入乳或含有乳制品的食物而引起的异常免疫反应，尤其影响婴幼儿及儿童（3岁以内）的身体健康，其发病率高达7.5%［1-4］。牛乳致敏蛋白质主要有酪蛋白质、β-乳球蛋白质、α-乳白蛋白质以及牛血清蛋白质等，其中β-乳球蛋白质被认为是其中重要的致敏蛋白质之一［5］。β-乳球蛋白质是一种重要的乳清蛋白质，约占牛乳总蛋白质的十分之一，其一级结构含有162个氨基酸残基，分子量约为18.4 kDa，存在两种基本形式，分别为变异体A和B［6］。β-乳球蛋白质不存在于母乳中，且不能被胃蛋白酶消化水解，因此可通过胃肠道进入血液循环［7］。因而被认为是牛乳中最主要的过敏原，刺激婴儿免疫系统发生超敏反应。研究表明：约82%的牛乳过敏病人都对β-乳球蛋白质过敏［8］。

目前，β-乳球蛋白质检测方法主要有两种：直接检测致敏性蛋白质的免疫学方法，如放射性变应原吸附试验（RAST）［9］，酶标记过敏原吸附抑制（EAST）［10］，火箭免疫电泳法（RIE）［11］，酶联免疫法（ELISA）［12］；间接指示过敏原组分存在的特异性DNA片段，主要是PCR［13-14］。酶联免疫法（ELISA）可直接检测出致敏性蛋白质，具有快速、灵敏、可商业化等优点，是目前应用最广泛的过敏原检测法［15-17］。但逐渐发现ELISA存在以下缺点：特异性抗体难获得，复杂的生物基质容易导致假阳性，加工过程酶、温度、压力破坏蛋白质的结构。而近年来发展起来的实时荧光定量PCR技术以其定量准确、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，逐渐应用于食品安全检测。DNA比较稳定，食品加工对其影响较小，因而基于DNA的常规PCR和实时荧光定量PCR可以作为蛋白质检测的补充方法。目前许庆金［18］等人建立了基于β-乳球蛋白质基因的常规PCR定性检测方法，但还未见β-乳球蛋白质基因的Taqman探针实时荧光PCR检测方法的相关报道。因此，本试验针对牛奶β-乳球蛋白质的基因序列，设计特异性引物和探针，首次建立牛奶β-乳球蛋白质过敏原的Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法，特异性检测食物中牛奶主要过敏原β-乳球蛋白质，并应用于市售食物中牛奶过敏原组分的快速检测，确保该方法的可靠性和准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛奶、饼干、蛋糕、饮料等食品，购于无锡欧尚超市。pMD19T-Vector Cloning Kit，PCR胶回收试剂盒，质粒DNA小量纯化试剂盒，2X PCR Master Mix，大连Takara公司提供；引物及探针（HPLC纯化），由上海生工生物工程有限公司合成；溴化乙锭（EB），TBE缓冲液，琼脂糖，上海生工生物工程有限公司产品；Tris-饱和酚、氯仿、乙醇及异戊醇等其它常规分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司；感受态菌，氨苄青霉素，LB培养基，由上海博仕生物医学服务中心（水源生物）提供。

1.2 仪器与设备

伯乐C1000TM型PCR仪，凝胶成像仪，美国Bio-rad（伯乐）公司制造；SLAN®全自动实时荧光定量PCR仪，上海宏石医疗科技有限公司制造；DYY-8C琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一制造厂制造；TU-1900型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司制造。

1.3 DNA的提取

参照田雨［19］、徐仙［20］等提取方法并稍加改动，提取市售鲜牛奶中的DNA：

1）取50 mL鲜牛奶置于4个100 mL的离心管中，4℃，12 000 r/min离心15 min，弃上清液，用棉球去除上层乳蛋白质和乳脂；

2）加入10 mmol/L PBS，溶解沉淀，4℃，12 000 r/ min离心10 min；

3）加入880 μL TEN（1 mL l mol/L Tris+0.2 mL 0.5mol/LEDTA+58gNaCl定容至100mL）和0.2moI/L NaOH溶液120 μL，悬浮沉淀并震荡混匀30 s，95℃条件下水浴8 min，期间颠倒混匀几次，4℃、12 000 r/ min离心10 min；

4）取上清液至灭菌离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（体积比25：24：1），剧烈震荡2～3 min，4℃，12 000 r/min离心10 min；

5）取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，12 000 r/min离心10 min；

6）上清液移入灭菌离心管，加入等体积预冷异丙醇，慢慢上下颠倒30s，-20℃条件放置30min；12000r/ min离心2 min，管底部有可见的白色DNA沉淀；

7）白色沉淀以体积分数70%乙醇洗涤2次，用N2气吹干至无乙醇味；

8）加50 μL TE缓冲液溶解，测其浓度；

9）用CTAB［21-22］法进行牛奶饮料及饼干样品的DNA提取。

1.4 引物和探针

根据NCBI上已公布的牛奶过敏原，将β-乳球蛋白质（β-Lg）基因的核酸序列，充分考虑检测引物和探针的退火温度的一致性、GC含量的相似性等因素，采用Primer select软件设计合成检测牛奶β-乳球蛋白质成分的引物和Taqman-BHQ探针，PCR目标扩增片段长度为226 bp。通过GenBank的Blast功能寻找该引物和探针的同源性，结果显示该基因具有很高的特异性，其他基因与该基因的同源性较小。引物和探针的序列见下表1。

表1 扩增β-乳球蛋白质的引物和探针Table 1Primers and Probe sequence for PCR detection of β-lactoglobulin

1.5 牛奶定性PCR扩增和电泳检测

用上述引物对3种市售鲜牛奶DNA进行扩增，每种样品都设置了3种退火温度（50，55，60℃），PCR扩增总体系30 μL：PCR Mixture 2×Mix 15 μL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），DNA模板2 μL，余下体积用灭菌超纯水补足至30 μL。同时设置空白对照，即在30 μL PCR体系中用等量超纯水代替DNA模板。PCR反应条件为起始模板预变性95℃，3 min；循环体：变性95℃30 s，退火（50、55、60℃）30 s，延伸72℃30 s，30个循环；72℃延伸10 min。

将上述PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳进行检测：将3 μL 6×Loading Buffer与6 μL PCR产物混合，加入质量分数1.5%琼脂糖凝胶点样孔中，在TBE电泳缓冲液中进行电泳，以DNA Maker 1000作为分子质量标准，100 V电泳45 min，凝胶成像仪观察结果。

1.6 目的基因与载体的连接、转化及鉴定

1.6.1 连接按试剂盒说明进行PCR胶回收纯化，以TaKara的pMD19-T vector作为载体进行连接，10 μL连接体系为：PCR回收片段4 μL，pMD19-T vector 1 μL，T4ligase 1 μL，10×T4ligase buffer 1 μL， dH2O 3 μL。16℃1 h，然后4℃过夜，第2天转化。

1.6.2 转化用氯化钙法将连接产物（10 μL）转入E.coli Top10感受态细胞中，冰浴30 min。42℃静止水浴45 s，再冰浴1 min。加入1 mL无抗性的LB，37℃，150r/min，复苏40min。12000r/min离心1min，去掉1 μL上清液，剩下的混匀涂于带有蓝白斑筛选氨苄抗性的培养板。培养板置培养箱，37℃过夜。

1.6.3 菌落PCR和测序鉴定以单菌落为模板进行阳性克隆菌落PCR扩增，反应条件同荧光定量PCR。琼脂糖电泳验证PCR扩增结果。将初步鉴定为阳性的菌落接种LBA液体培养基，37℃培养过夜，第2天抽提并纯化质粒DNA。重组质粒测序，验证重组质粒是否构建成功。其同源性比较采用Gene Bank中的BLAST进行分析。

1.7 实时荧光定量PCR

将重组质粒pMD19T-Lg用HindIII单酶切成线性化的标准模板质粒并定量，线性化质粒转化为相应的拷贝数为3.18×109，按10倍梯度稀释，选择3.18×103～3.18×107拷贝数标准品进行Taqman探针法实时荧光定量PCR扩增反应。定量PCR反应体系为：总体积30 μL，其中含2×qPCR mix 15 μL，上下游引物各0.5μL（10μmol/L），探针1μL（10μmol/L），模板DNA 2 μL，灭菌超纯水11 μL。实时荧光定量PCR运行条件同定性PCR优化好的条件：95℃3 min；94℃30 s；55℃30 s，72℃30 s检测荧光信号，30个循环，72℃保温10 min。以初始模板量对数值为横坐标，以循环阈值（Ct）为纵坐标绘制标准曲线。

1.8 实际样品检测

为对本研究中建立的Taqman探针实时荧光定量PCR方法的实用性进行考察，对10种食品牛奶过敏原β-乳球蛋白质进行检测。利用CTAB法对牛奶饮料及饼干基因组DNA进行提取，以提取的基因组DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增。利用标准曲线计算其β-乳球蛋白质过敏原基因拷贝数，利用检测限来判断实际样品是否含有牛奶β-乳球蛋白质过敏原。

2 结果与分析

2.1 牛奶基因组DNA的提取

经测定提取的DNA基因组的OD260/OD280在1.7左右，DNA纯度较好，浓度较高，可用于后续PCR扩增试验。见表2。

表2 样本基因组DNA测定值Table 2Detection results of DNA obtained from food samples

2.2 PCR定性分析

分别以提取的光明、现代、特仑苏鲜牛奶基因组DNA为模板进行定性PCR检测，PCR的电泳结果（图1）表明，通过本研究中设计的引物可从商业牛奶基因组DNA中扩增出牛的β-乳球蛋白质的预期条带，且退火温度为55℃时条带较亮，扩增效率较高，因此选用55℃进行后续定量的扩增实验。根据此结果将扩增得到的PCR条带进行割胶回收做T/A克隆，构建pMD19T-Lg载体。

图1 不同牛奶基因组DNA及退火温度的定性PCR产物Fig.1PCR products from extracted genomic DNA of three commercial milk with different annealing temperature.

2.3 重组质粒的鉴定

连接产物转化后挑取5个单菌落进行菌落PCR鉴定，PCR产物经质量分数2%琼脂糖电泳。图2为菌落PCR扩增电泳结果，在226 bp处出现条带，与目的片段大小一致，初步判断为阳性克隆。

图2 重组质粒菌落PCR结果Fig.2Colony PCR analysis of the recombinant plasmid

选取亮度最大的1、2号菌落接种培养，提取质粒进行DNA序列测定，测序结果通过NCBI上的blast进行同源性比对分析。结果表明，克隆的序列与GenBank中已登录的牛的β-乳球蛋白质基因序列完全一致，同源性达到100%。说明插入的外源基因即为目的片段，即重组质粒构建成功。标准模板测序结果如图3所示。

图3 标准模板β-乳球蛋白质基因片段DNA测序结果Fig.3DNA sequence analysis of β-Lg allergen gene fragment as a standard template

2.4 实时荧光定量PCR标准曲线

将重组质粒pMD19T-Lg用HindIII进行单酶切，回收线性化的质粒作为标准品。将质粒标准品10倍稀释作为扩增模板，每个梯度重复3次测定。实验结果表明，在3.18×107～3.18×103拷贝数范围内，Ct值与模板DNA分子的起始拷贝数的对数值呈良好的线性关系（见图4），以基因拷贝数的对数值为横坐标，以相应的Ct值为纵坐标作图，制作标准曲线，R2为0.997 8，标准曲线回归方程为

式中：y为循环阈值（Cycle Threshold，Ct）；x为质粒DNA拷贝数对数值（见图5）。通过标准曲线方程和样品的Ct值便可计算出样品中所测组分DNA的含量。

2.5 方法学评价

2.5.1 灵敏度分析取β-Lg重组质粒标准品10倍梯度稀释（3，31，3.18×102，3.18×103，3.18×104，3.18× 105copies/μL），以其为模板进行实时荧光定量PCR扩增。结果显示，最小检测拷贝数属318 copies/μL的β-Lg样品。见图6。

图4 标准模板质粒pMD19T-Lg DNA系列梯度的扩增曲线Fig.4Establishment of amplification curve for detection of α-La DNA template by Real-time PCR

图5 牛奶β-乳球蛋白质Taqman实时荧光定量PCR标准曲线Fig 5Standard curve for detection of milk β-La gene by real-time PCR

图6 荧光定量PCR灵敏度试验Fig 6Sensitivity tests of real-time PCR

2.5.2 特异性分析为考察所建立的Taqman探针荧光定量PCR检测法是否能特异性针对牛奶β-乳球蛋白质基因，以鲜牛奶基因组DNA为阳性对照，提取羊奶、豆浆，牛奶饮料、牛奶饼干食物基因组DNA，PCR扩增后进行质量分数2%琼脂糖凝胶电泳。见图7。结果显示，仅牛奶及奶制品食物基因组DNA扩增出目的片段，羊奶及豆浆基因组DNA扩增均成阴性。说明建立的实时荧光定量PCR具有较好的特异性。

图7 荧光定量PCR特异性试验Fig.7 Specificity tests of real-time PCR

2.5.3 重复性分析选择浓度为3.18×103、3.18× 105、3.18×107copies/μL的质粒标准品进行重复性实验。组内：同一时间同一反应条件下，对3个浓度的质粒标准品进行3次试验，分析组内重复性。组间：6 d内对3个浓度的标准品分别单独进行3次Taqman实时荧光定量PCR测定，分析组间重复性。结果如表3所示，变异系数CV均在5%以内，说明建立Taqman实时荧光定量PCR方法重复性较好。

表3 荧光定量PCR的重复性结果Table 3Reproducibility test of the real-time PCR

2.6 实际样品检测

利用建立的荧光定量PCR方法对10种食品中的牛奶主要过敏原β-乳球蛋白质基因进行检测，以复原乳为阳性对照，ddH2O为阴性对照。利用田雨提取牛奶DNA法［19］，对液体样品进行基因组DNA提取，利用改进的CTAB法对饼干等固体食品的基因组DNA进行提取，进行实时PCR扩增。根据本研究的灵敏度318 copies/μL来考察食品是否含有牛奶β-乳球蛋白质过敏原。表4为检测结果，8种标签标示牛奶过敏原的食品中7种β-乳球蛋白质检测呈阳性，其中果粒奶优虽然标示有牛奶，但是重复3次检测结果均为阴性，推断可能原因为果粒奶优饮料含有牛奶量较少或食品加工过程对DNA破坏较大，影响实时荧光定量PCR检测结果。豆浆及果汁检测结果均为阴性，与标示一致。检测结果表明，建立的荧光定量PCR法用于食品检测具有较高的准确性和可靠性，符合率达90%，可用于市售食品的牛奶过敏原检测。

表4 市售食品中牛奶过敏原β-乳球蛋白质的检测结果Table 4Detection results of commercial food

3 讨论

为避免消费者误食过敏原导致严重的过敏反应，提供消费者清晰准确的食物过敏原信息至关重要。因此，美国（USA）和欧盟（EU）近来都制定了规范食品过敏原标签的法律法规。2010年我国修订国家标准《GB/T23779—2009预包装食品中的致敏原成分》，要求食品标签增加牛奶等其他过敏原的标识。因此，迫切需要建立快速、灵敏、特别的牛奶过敏原检测方法，以为食品过敏原的标识提供支持保障。

本研究中根据NCBI登录的β-乳球蛋白质核酸序列，设计了一对特异性引物和探针，对目标基因β-乳球蛋白质的一段DNA序列进行荧光定量PCR扩增，构建重组质粒标准品，建立标准曲线。结果表明，该质粒作为标准模板建立的标准曲线线性关系良好，在3.18×107～3.18×103拷贝数范围内，Ct值与质粒拷贝数的对数值呈线性关系，通过标准曲线，可对目的基因浓度进行准确定量。与许庆金等人建立的β-乳球蛋白质常规PCR检测方法相比，Taqman探针实时荧光定量PCR可省去电泳步骤、简便安全、灵敏度高、特异性强，并且实现了定性PCR到定量PCR的飞跃。用本研究中设计的引物和探针对羊奶、豆浆及饼干、饮料进行扩增，结果显示该检测方法特异性针对牛奶β-乳球蛋白质，灵敏度达到318 copies/μL。根据建立的灵敏度对10种食品进行检测，除果粒奶优饮料检测结果与标签不符，推测该饮料DNA破坏严重或含量较低影响检测，其他食品检测结果与标签过敏原标识一致，说明该方法具有较高的可靠性和准确性。

4 结语

作者建立的Taqman探针实时荧光定量PCR方法，用于食品中牛奶主要过敏原β-乳球蛋白质基因的检测，为食品致敏原的标签管理和检测提供了可靠的技术支持。Taqman实时荧光定量法可定量分析食品中β-乳球蛋白质含量，与常规PCR方法相比具有灵敏、快速、特异、简单、安全等优点。与直接检测致敏性蛋白质的免疫分析方法相比，可大大降低复杂生物基质中交叉反应导致的假阳性结果，避免对大量抗体的需求，而DNA比蛋白质稳定，受食品加工条件影响较小，因此可通过对过敏原DNA片段的检测间接指示食物过敏原组分的存在。基于以上优点，本试验中建立的实时荧光定量PCR检测方法可作为目前常用的免疫检测的有效补充，为食物牛奶过敏原的检测提供可靠的保障，可推广到食品中牛奶过敏原实际的检测。

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Establishment of a Taqman Real-Time Quantitative PCR for the Detection of β-Lactoglobulin Gene

JIA Min1，ZHANG Yinzhi2，ZHANG Yifan3，SUN Xiulan*1，2
（1.School of Food Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Hanzhong Products Quality Supervision and Inspection Institute，Hanzhong 723000，China）

The research aimed to establish a Taqman real-time fluorescence quantitative assay for the rapid detection of milk allergen β-lactoglobulin in food.Specific primers and Taqman probe were first designed based on the gene sequence of β-lactoglobulin for real-time PCR.The purified DNA product was linked with the pMDl9-T vector to construct recombined plasmids as a standard PCR template.Plasmids were then identified with colony PCR and subjected to sequencing.Real-time fluorescence PCR assay was performed with plasmids and the standard curve was constructed with DNA copies and Ct.Sensitivity，specificity，reproducibility and application of the real-time method were also evaluated.Results showed that the β-lactoglobulin DNA fragment was successfully clonedand the standard curve had a good linear relationship ranging from 3.18×103to 3.18×107copies.The detection sensitivity reached up to 318 copies/μL.Furthermore，specificity and stability of the method were good.Ten foods were detected with the β-Lg DNA residue and the results were consistent well with their allergen labels.Therefore，the method may become a complementary tool for milk allergen detection and it is applicable for other food allergens.

milk allergen，β-lactoglobulin，Taqman real-time quantitative PCR，detection

52.1；TS252.7

A

1673—1689（2015）06—0605—08

2014-06-30

国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAK10B03）

*通信作者：孙秀兰（1976-），女，山东聊城人，工学博士，教授，主要从事食品安全检测研究。E-mail：sxlzzz@yahoo.com.cn