马齿苋籽粕蛋白的提取及分离纯化*

董衡情，王聪，郑莲，敬思群

(新疆大学 生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐，830046)

马齿苋(Portulaca oleraceaL.)为马齿苋科马齿苋属植物，又名长寿菜、安乐草，资源丰富，具有降血脂、延缓衰老、提高机体免疫力等功能［1］，具有很高的营养和药用价值［2－4］。

马齿苋籽产油率17.68%，其籽粕产量在82%～90%［5］，而籽粕中蛋白质含量为10.00%。本研究采用碱溶酸沉法［6－9］提取马齿苋籽粕蛋白，并使用蛋白层析仪对其进行了分离纯化。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

脱脂马齿苋籽粕:实验室自制(亚临界异丁烷法萃取马齿苋籽油的副产品，亚临界萃取工艺条件为:萃取压力0.8 MPa，萃取温度40℃，萃取时间150 min;采用凯氏定氮法测得籽粕中蛋白质含量为10.00%);NaOH、HCl、NaH2PO4、Na2HPO4和(NH4)2SO4，均为国产分析纯;UNOsphereTMQ Anion Exchange Support阴离子交换填料，BIO RAD公司;蒸馏水，实验室自制。

HH-S2型恒温水浴锅，巩义市英峪予华有限公司;pHS-3C实验室pH计，上海虹益仪器仪表有限公司;AL-104电子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司;FZ102-SIM真空冷冻干燥设备，德国西门子公司;BioLogic LP(731-8350)层析仪，BIO RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 马齿苋籽粕蛋白提取工艺流程

马齿苋脱脂籽粕→预处理→碱提→离心→上清液→酸沉→离心→沉淀→水洗至中性→冷冻干燥→马齿苋籽粕粗蛋白1.2.2 操作要点

(1)预处理:将脱脂马齿苋籽粕干燥、过80目筛。

(2)碱液浸提:将马齿苋籽粕与NaOH溶液按液料比25∶1(mL∶g)混合，在50℃恒温水浴锅中浸提20 min，使蛋白质溶于NaOH溶液中。

(3)离心:用离心机以3 000 r/min的转速离心20 min，取上清液。

(4)酸沉:用0.1 mol/L的HCl调节上清液的pH至等电点4.0，使蛋白质析出。

(5)离心:再用离心机以3 000 r/min的转速离心20 min，取沉淀，将析出的蛋白质分离出来，并用蒸馏水水洗至中性，转移至培养皿中。

(6)冷冻干燥:先将冷冻干燥机温度降到－50℃以下，放入预先在－20℃冷冻12 h的样品(保证没有液态水存在)，冷冻干燥12 h，反复2次，制得马齿苋籽粕粗蛋白的冻干粉。

1.2.3 马齿苋籽粕蛋白分离纯化试验预处理

对固定相的预处理参考李佳梅［10］的方法并稍做改进。未知蛋白的分离纯化，一般先选择阴离子交换柱进行试验，在未洗脱出蛋白的情况下再考虑选用阳离子交换柱。本试验选用BIO-RAD公司提供的UNOsphereTMQ Anion Exchange Support阴离子交换填料。对样品的预处理参考了邵明飞［11］等一步柱层析纯化螺旋藻藻蓝蛋白的方法。

称取2 g的马齿苋籽粕蛋白，加入到100 mL磷酸盐缓冲液(0.002 mol/L，pH值7.0)中，搅拌均匀，混合液缓慢加入(NH4)2SO4至其终浓度为1.25 mol/L，持续低速搅拌1 h，放于4℃冰箱静置12 h，离心(3 000 r/min，30 min)，上清液即为20 g/L的马齿苋籽粕蛋白溶液。

1.2.4 马齿苋籽粕蛋白分离纯化工艺流程

马齿苋籽粕粗蛋白→预处理→过阴离子交换柱(固定相预处理→装柱→平衡→上样→洗脱→检测)→(NH4)2SO4溶液梯度洗脱→自动检测蛋白→绘出洗脱曲线→合并峰值蛋白→透析→冷冻干燥→纯化后的马齿苋籽粕蛋白

1.2.5 分析和计算

试验参考Gofferje'［12］等对麻疯树籽粕蛋白的提取试验中对籽粕的蛋白质、水分、灰分做基本成分测定。马齿苋籽粕中的化学成分定量分析均采用国家标准方法，包括蛋白质的测定［13］、水分的测定［14］、灰分的测定［15］。马齿苋籽粕中蛋白质、水分、灰分的含量分别为10.00%、4.01%和10.25%。

2 结果与分析

2.1 马齿苋籽粕蛋白提取单因素试验结果

2.1.1 碱液pH值对马齿苋籽粕蛋白提取率的影响

液料比20∶1(mL∶g)、提取时间 30 min、提取温度45 ℃，分别取 pH 值为9、10、11、12、13 的 NaOH 溶液提取马齿苋籽粕中的蛋白质，以蛋白质提取率为指标，试验结果如图1所示。

图1 NaOH溶液pH值对马齿苋籽粕蛋白提取率的影响Fig.1 Effects of Lye pH on the extraction rates ofpurslane seed meal protein

马齿苋籽粕蛋白提取率随碱液pH值的升高而增大，而且在pH 9～11内增幅较明显(蛋白质提取率由20.23% 增至49.63%)。pH值大于11，蛋白的提取率虽然也增加，但提取液较黏稠，呈深黄褐色，酸沉时会消耗大量的盐酸，使产品中盐分增加，不利于后续离心分离工艺的实施。因此，提取马齿苋籽粕蛋白的最适pH值为11。

2.1.2 液料比对马齿苋籽粕蛋白提取率的影响

pH值为11、提取时间30 min、提取温度45℃，分别取液料比(mL∶g)为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1提取马齿苋籽粕中的蛋白质。以蛋白质提取率为指标，试验结果如图2所示。

图2 液料比对马齿苋籽粕蛋白提取率的影响Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on extraction rates of purslane seed meal protein

马齿苋籽粕蛋白的提取率随液料比的增加而升高。尽管液料比为25∶1(蛋白提取率53.28%)高于20∶1(蛋白提取率51.09%)的实验组，但其蛋白提取率增幅较小，而耗水量与用碱量都会大大增加。从经济角度考虑，选择液料比20∶1较为合适。

2.1.3 浸提温度对马齿苋籽粕蛋白提取率的影响

pH 值为11、液料比 20∶1(mL∶g)、提取时间 30 min，提取温度分别为 30、35、40、45、50 ℃，提取马齿苋籽粕中的蛋白质。以蛋白质提取率为指标，试验结果如图3所示。

图3 浸提温度对马齿苋籽粕蛋白提取率的影响Fig.3 Effects of temperature on the extraction rates of purslane seeds meal protein

在30～60℃内，马齿苋籽粕蛋白的提取率随反应温度的升高而增大，当温度为45℃时，蛋白提取率52.65%，温度为50℃，提取率为54.04%，增幅较小，且由于蛋白在50～60℃易受热变性，因此最适提取温度为45℃。

2.1.4 浸提时间对马齿苋籽粕蛋白提取率的影响

pH值为11、液料比20∶1(mL∶g)、提取温度 45℃，提取时间分别为 10、20、30、40、50 min，提取马齿苋籽粕中的蛋白质，试验结果如图4所示。

图4 浸提时间对马齿苋籽粕蛋白取率的影响Fig.4 Effects of time on the extraction rates ofpurslane seeds meal protein

随着浸提时间的延长，马齿苋籽粕蛋白的提取率呈升高趋势，但幅度不太明显，表明浸提时间对马齿苋籽粕蛋白提取率的影响较小。浸提时间从30 min增至50 min，蛋白提取率仅由47.10%增至50.63%，而提取时间增长会增加经济成本，因此，最适提取时间30 min。

2.2 正交试验优化马齿苋籽粕蛋白提取工艺

根据单因素试验结果，选择碱液pH、液料比(mL∶g)、温度、时间做L9(34)四因素三水平正交优化试验，试验结果及方差分析分别见表1和表2。

表1 正交优化试验结果表Table 1 Experimental results of orthogonal

表2 各因素方差分析表Table 2 The ANOVA table of each factor

影响蛋白质提取率的各因素的主次关系从大到小依次为:碱液pH、液料比、温度、时间。各因素的最优水平组合为A3B3C1D3，即采用pH值为12的NaOH溶液、液料比25∶1(mL∶g)、50 ℃条件下提取20 min，即可达到最佳提取效果。经验证试验测得平均提取率为56.04%，此时马齿苋籽粕蛋白纯度(以蛋白质含量计)为58.53%。相对标准偏差RSD=1.1%，表明结果重复性良好，说明所选最优工艺条件合理。

2.3 马齿苋籽粕蛋白等电点的确定

按马齿苋籽粕蛋白的最优提取工艺，即液料比25∶1(mL∶g)，pH值为12的碱液，在45℃恒温水浴中浸提20 min，通过测定蛋白质的提取率来确定酸沉的最适pH值，即为蛋白质等电点。从图5中可看出，马齿苋籽粕蛋白的等电点在4.0，即pI=4.0。

图5 马齿苋籽粕蛋白等电点测定结果Fig.5 Purslane seed meal protein isoelectric point determination results

2.4 马齿苋籽粕蛋白分离纯化工艺确定

2.4.1 洗脱液流速的选择

洗脱速度为0.3 mL/min和0.5 mL/min时，洗脱一段时间之后柱子中的液体低于或远高于填料平面，不符合要求。所以洗脱液流速初选0.4 mL/min，当流速为0.4 mL/min时，峰的分辨率不太高，峰形近似对称。其原因可能是在较低的流速条件下，溶质的扩散作用，使得谱带扩张而峰形宽，分辨率下降［13］。

2.4.2 上样量的选择

当上样量为1 mL时，峰的分辨率不高，峰型不明显，近似平稳，上样量为5 mL时，峰比较明显，但是峰形较宽，分辨率不高。上样量增加导致峰形较宽［10］，当上样量为3 mL时，峰形较窄，分辨率较高且峰形近似对称。所以初步确定最佳上样量为3 mL。洗脱曲线见图6。因此分离纯化最适工艺为:上样量为3 mL，洗脱液流速为0.4 mL/min，同时表明阴离子交换填料适合于马齿苋籽粕蛋白的分离纯化。将处于峰值的试管中的液体收集到透析袋中，进行透析、冷冻干燥，得到分离纯化的马齿苋籽粕蛋白，其含量(以蛋白质含量计)为91.02%，比纯化前提高了32.49%。

图6 洗脱曲线Fig.6 Elutioncuves

3 结论

马齿苋籽粕蛋白最优提取工艺为:液料比25∶1(mL∶g)，碱液pH值12，浸提温度50℃，浸提时间20 min，提取率56.04%，马齿苋籽粕蛋白含量(以蛋白质含量计)为58.53%，马齿苋籽粕蛋白的等电点pI=4.0;马齿苋籽粕蛋白的分离纯化最优工艺为:上样量为3 mL，洗脱液流速为0.4 mL/min。马齿苋籽粕蛋白含量(以蛋白质含量计)为91.02%，比分离纯化前提高了32.49%。

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