小分子靶向受体酪氨酸激酶抑制剂TW9183的合成及体外抗肿瘤活性

雷春花，王雪玉，杨育才，吴振，王立强

（1.华侨大学 生物医学学院，福建 泉州362021；2.台湾大学 生化科学系，台湾 台北106170；3.厦门大学 药学院，福建 厦门361101）

目前，酪氨酸激酶是国际上抗肿瘤药物研发的重要靶点［1］.吉非替尼是一种苯胺喹唑啉类酪氨酸激酶抑制剂［2］，于2003年获美国食品和药物管理局批准上市，作为非小细胞肺癌的靶向治疗药物.喹唑啉类化合物的构效关系表明，药效母核喹唑啉环上3－位的N 原子可被C 取代，形成具有较强药理活性的喹啉类化合物［3］.研究表明，苯胺嘧啶类化合物也是一类重要的蛋白激酶抑制剂，对多种蛋白激酶有较好的抑制效果，许多已上市和临床阶段的药物中含有此结构单元［4］.课题组以吉非替尼为先导，以喹啉环替代喹唑啉，在外侧苯环的4－位引入不同的苯胺嘧啶化合物，合成了一系列结构新颖的喹啉衍生物.经前期体外活性验证与计算机辅助的结构优化，筛选出候选药物TW9183，其化学名称为4－（7－氯喹啉－4－氨基）－N－｛4－甲基－3－［4－（4－吡啶）嘧啶－2－氨基］苯基｝苯甲酰胺，分子式为C32H24ClN7O.本文对TW9183的合成方法及其对3种人类肿瘤细胞株的体外抗肿瘤作用进行研究.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

人宫颈癌Hela、人非小细胞肺癌A549、人肝癌SMMC－7721、HUVEC 细胞株（上海中科院细胞库）；MEM，F－12K 和RPMI－1640培养基（美国Invitrogen公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Sigma公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Amresco 公司）；结晶紫、Hoechst 33342染色液、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒（上海市碧云天生物技术研究所）；兔抗人Caspase－3抗体、兔抗人Actin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（美国Abcam 公司）；吉非替尼（辽宁省大连美仑生物技术有限公司）；其他合成试剂（上海泰坦科技股份有限公司）.

PB－10型pH 计、BS 224S型电子天平（德国Sartorius公司）；Infinite M200型全功能酶标仪（西班牙Tecan Iberica公司）；Eclipse TE2000－U 型荧光倒置显微镜（日本Nikon公司）；ChemiDoc XRS型凝胶成像系统、Mini－PROTEAN Tetra C型垂直板电泳和转膜装置（美国Bio－Rad公司）；FACS Calibur型流式细胞仪（美国BD 公司）；FRESCO 21型离心机（美国Thermo公司）；WRR 型熔点仪（上海精密科学仪器有限公司）；Vario EL Ⅲ型元素分析仪（德国Elementar公司）；N－1001型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会所）；UNION 400型氢谱、碳谱（美国Varian公司）；Esquire 3000plus型质谱仪（美国Bruker公司）.

1.2 TW9183的合成

化合物TW9183的合成路线，如图1所示.

图1 TW9183的合成路线Fig.1 Synthesis route of TW9183

1.2.1 4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酸（Ⅰ）的合成 在100mL 的圆底烧瓶中加入4，7－二氯喹啉1.96g（10mmol）、对氨基苯甲酸1.36g（10mmol）和异丙醇（i－PrOH）20mL，搅拌使其充分溶解.缓慢升温至85 ℃，搅拌回流5h，薄层色谱（TLC）监测反应完全后，将反应液冷却至室温，减压蒸干，残留固体用30 mL二氯甲烷洗涤2次，抽滤得黄色固体中间体（I）4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酸2.68g，收率为90%.

1.2.2 4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酰氯（Ⅱ）的合成 在100mL 干燥的圆底烧瓶中加入含2.982g（10 mmol）中间体I的干燥二氯甲烷溶液15mL，搅拌，0 ℃冰浴下缓慢滴加氯化亚砜5.35g（45mmol），回流3h，减压蒸馏，得到淡黄色固体中间体（Ⅱ）4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酰氯2.71g，收率为95%.

1.2.3 TW9183的合成 在100mL干燥的圆底烧瓶中加入含中间体Ⅱ3.162g（10mmol）及2－（5－氨基－2－甲基苯胺）－4－（4－吡啶）嘧啶2.35g（8.5mmol）的四氢呋喃溶液40mL，搅拌.0 ℃冰浴下缓慢滴加三乙胺（Et3N）1.717g（17mmol），搅拌30min，45℃下反应7h.TLC检测反应完全后，抽滤，滤液减压蒸馏，固体用50mL 乙酸乙酯溶解，80mL 水萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，用二氯甲烷／甲醇重结晶，得目标产物（TW9183）4.02g，收率为85%，熔点为292～296 ℃.

1.3 细胞培养

Hela，SMMC－7721，A549和HUVEC 细胞株分别接种于含体积分数为10%胎牛血清的MEM，RPMI－1640，F－12K 培养基中，置于37 ℃，体积分数为5% 的二氧化碳培养箱中培养，所有实验均采用对数生长期细胞.

1.4 MTT法测定细胞的增殖能力

将Hela，A549，SMMC－7721，HUVEC细胞以4×103个·孔－1接种于96孔培养板中.细胞完全贴壁后，分别给予不同浓度的TW9183（2，4，8，16μmol·L－1）.阳性对照组给予相同浓度的吉非替尼，阴性对照组给予相同体积的DMSO，培养48h后加MTT 检测，计算半数抑制浓度（IC50）和相对细胞增殖率（RGR），实验重复3次.

1.5 平板克隆法测定细胞的克隆形成能力

将Hela，A549，SMMC－7721细胞以300个·孔－1接种于6孔板中.细胞完全贴壁后，药物处理同节1.4.48h后更换培养液，培养至培养板中出现肉眼可见的集落时终止，弃培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗1次，加入1mL质量分数为4%的多聚甲醛固定10min，弃多聚甲醛，PBS洗2～3次，加600 μL结晶紫染色液染色10min，流水洗去结晶紫，空气中干燥，计算克隆形成率，实验重复3次.

1.6 划痕法测定细胞的迁移能力

将Hela，A549，SMMC－7721细胞以1×105个·孔－1接种于24孔板中.细胞完全贴壁后，用200 μL移液枪枪头在单层细胞上呈"一"字划痕，弃培养液，PBS洗2次，药物处理同节1.4.48h后，置于倒置显微镜下观察并测量细胞发生迁移后的损伤距离，计算迁移率，实验重复3次.

1.7 Hoechst 33342法检测凋亡细胞形态

将Hela，A549，SMMC－7721细胞以4×103个·孔－1接种于96孔板中.细胞完全贴壁后，药物处理同节1.4.48h后吸弃培养液，每孔加入100μL质量分数为4%的多聚甲醛固定30min，吸弃多聚甲醛，PBS荡洗，每孔加入80μL Hoechst 33342染色10min，吸弃染色液，PBS荡洗，于荧光显微镜下观察，实验重复3次.

1.8 蛋白免疫印迹检测caspase-3蛋白的表达

将Hela，A549，SMMC－7721细胞以5×105个·孔－1接种于96孔板中.细胞完全贴壁后，分别给予不同浓度的TW9183（4，8，16μmol·L－1），阴性对照组给予同体积的DMSO.48h后吸弃培养基，PBS洗涤2次，每孔加入150μL Western及IP细胞裂解液，冰浴裂解30min，1 000r·min－1离心5min，收集上清液，凝胶电泳分离蛋白.将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜上，质量分数为5%脱脂奶粉封闭后，一抗4 ℃封闭过夜，二抗室温封闭2h，ECL显色1～2min，荧光成像仪内曝光、检测，实验重复3次.

1.9 流式细胞术检测细胞周期分布

将Hela，A549，SMMC－7721细胞以2×105个·孔－1接种于6孔板中.细胞完全贴壁后，药物处理同节1.4.48h后消化并收集细胞，4℃固定过夜，加入0.5mL配制好的染色液（含PI，RNA 酶，染色缓冲液），缓慢并充分重悬细胞沉淀，于37 ℃避光温浴30min，用流式细胞仪检测，实验重复3次.

2 结果与讨论

2.1 TW9183的合成及结构鉴定

TW9183的详细合成路线，如图1所示.中间体I的结构经1H－NMR，13C－NMR 和ESI－MS表征确证，目标产物的结构经IR，1H－NMR，13C－NMR，ESI－MS和元素分析表征确证，具体结果如下所述.

4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酸（Ⅰ）为黄色固体粉末，收率为90%.1H－NMR（400MHz，DMSO－d6），δ值：8.61（d，J＝9.29Hz，1H），8.47（d，J＝7.03 Hz，1H），8.23～8.26（m，2H），8.00（d，J＝2.01 Hz，1H），7.86（dd，J＝9.29Hz，2.26Hz，1H），7.63（dd，J＝6.78Hz，2.01Hz，2H），7.11（d，J＝7.03Hz，1H）.13C－NMR（400MHz，DMSO－d6），δ值：168.41，150.39，149.52，148.36，147.21，136.12，132.15，130.21，126.83，123.29，21.38，18.26，115.17，112.85.ESI－MS，m／z为298.7［M－H］－.

4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酰氯（Ⅱ）为淡黄色固体粉末，收率为95%.

4－（7－氯喹啉－4－氨基）－N－｛4－甲基－3－［4－（4－吡啶）嘧啶－2－氨基］苯基｝苯甲酰胺（TW9183）为淡黄色的固体粉末，收率为85%，其熔点为292～296℃.IR（KBr），σ／cm－1：3 447，3 427，3 372，3 226，3 065，3 014，1 625，1 595，1 574，1 507，1 427，1 386，1 361，1 313，1 225，1 166，1 020，746.1H－NMR （400 MHz，DMSO－d6），δ值：2.25（s，3H），7.01（d，J＝7.00Hz，1H），7.24（d，J＝8.54Hz，1H），7.47（d，J＝5.26Hz，1H），7.51（dd，J＝8.04Hz，2.04 Hz，1H），7.64（d，J＝7.76 Hz，1H），7.65（d，J＝8.76 Hz，2H），7.93（dd，J＝9.04Hz，2.00Hz，1H），8.12（d，J＝2.24Hz，1H），8.14（d，J＝2.04Hz，1H），8.18（d，J＝8.54Hz，2H），8.55（d，J＝5.26Hz，1H），8.62（dd，J＝6.14Hz，2.00Hz，1H），8.63（d，J＝6.8Hz，1H），8.76（d，J＝4.76Hz，1H），8.79（d，J＝9.04 Hz，1H），9.06（s，1H），9.34（s，1H），10.36（s，1H），11.14（s，1H）.13C－NMR（400 MHz，DMSO－d6），δ值：18.11，101.36，108.11，116.73，117.36，117.78，119.96，124.79，125.06，126.37，128.14，128.27，129.92，130.58，133.19，134.04，136.25，137.52，138.23，139.14，139.59，140.35，144.47，147.57，150.63，155.00，158.68，159.02，160.01，161.58，161.64，164.88.ESI－MS，m／z为558.2［M＋H］＋.Anal.（C32H24ClN7O）：calcd C 68.87，H 4.30，Cl 6.37，N 17.58，O 2.87；found C 68.79，H 4.32，Cl 6.35，N 17.56，O 2.88.

2.2 TW9183对肿瘤细胞和HUVEC细胞增殖的影响

给药48h后，阴性对照组细胞均贴壁生长旺盛，细胞呈多角形，胞质饱满，相邻细胞生长融合成片，而给药组细胞随着给药浓度的增加细胞数明显减少，Hela细胞发生皱缩，逐渐漂浮起来，A549 和SMMC－7721细胞体积变大，扁平铺展.以细胞膨大为特征的细胞衰老是一种重要的抑瘤机制［4］.因此，TW9183可能通过促进A549和SMMC－7721细胞的衰老达到抑制肿瘤的效果.TW9183对人肿瘤细胞的抗增殖作用，如表1所示.由表1可知：TW9183对Hela，A549和SMMC－7721 肿瘤细胞株表现出比吉非替尼更高的抑制力，表明TW9183可能具有潜在对宫颈癌、肺癌和肝癌的治疗作用.TW9183对HUVEC细胞相对增殖率的影响，如图2所示.由图2可知：TW9183作用后的HUVEC细胞相对增殖率较大，与阴性对照组差异无统计学意义（P＞0.05），表明TW9183对正常HUVEC细胞在化合物作用范围内没有毒性.

表1 TW9183对人肿瘤细胞的 抗增殖作用（n＝3）Tab.1 Anti－proliferation activity of TW9183on human tumor cells（n＝3）

2.3 TW9183对肿瘤细胞克隆形成的影响

肿瘤细胞的克隆形成能力反映了细胞的群体依赖性和增殖能力，是肿瘤细胞成瘤的一个重要因素.TW9183作用于肿瘤细胞后，细胞的克隆形成能力不同程度地减弱，其中，TW9183降低Hela肿瘤细胞集落形成能力最为显著.对3种肿瘤细胞集落形成的统计值（η1），如图3所示.图3中：横坐标1～5分别代表0，2，4，8，16μmol·L－1的TW9183，6代表16μmol·L－1的吉非替尼；与阴性对照组相比，a代表P＜0.05，b代表P＜0.01；与相同浓度吉非替尼组（16.0μmol·L－1）相比，c代表P＜0.01.由图3可知：TW9183抑制Hela，A549和SMMC－7721克隆形成的作用效果强于吉非替尼.

图2 TW9183对HUVEC细胞相对增殖率的影响Fig.2 Effects of TW9183on relative growth rate in HUVEC cell

图3 TW9183对Hela，A549和SMMC－7721细胞克隆形成的影响Fig.3 Effects of TW9183on colony formation in Hela，A549and SMMC－7721cells

2.4 TW9183对肿瘤细胞迁移的影响

肿瘤转移是肿瘤致死的主要原因［5－6］，也是人们防治肿瘤时关注的重要因素.TW9183能不同程度地抑制Hela，A549和SMMC－7721细胞的迁移，其影响如图4所示.图4中：A，B，C，D，E 分别为0，2，4，8，16μmol·L－1的TW9183，F为16μmol·L－1的吉非替尼（×100）.给药48h后，阴性对照组的划痕宽度不断缩小，而给药组随着给药浓度的增加，划痕愈合程度逐渐降低，细胞迁移率（η2）明显降低，与阴性对照组相比具有统计学意义（P＜0.01），且高剂量组TW9183（16.0μmol·L－1）作用后的Hela细胞迁移率明显低于吉非替尼对照组（P＜0.05），但对A549和SMMC－7721细胞的迁移抑制作用与吉非替尼组无统计学意义.TW9183对Hela，A549和SMMC－7721细胞迁移率的影响，如图5所示.图5中：1～5分别代表浓度为0，2，4，8，16μmol·L－1的TW9183，6代表浓度为16μmol·L－1的吉非替尼；与阴性对照组相比，b代表P＜0.01；与相同浓度吉非替尼（16.0μmol·L－1）组相比，c代表P＜0.05.

2.5 TW9183对肿瘤细胞凋亡的影响

图4 TW9183对Hela，A549和SMMC－7721细胞迁移的影响Fig.4 Effects of TW9183on migration in Hela，A549，and SMMC－7721cells

图5 TW9183对Hela，A549和SMMC－7721细胞迁移率的影响Fig.5 Effects of TW9183on migration rate in Hela，A549，and SMMC－7721cells

TW9183作用于3种肿瘤细胞后，细胞数明显减少，荧光强度增加，而阴性对照组细胞的细胞核形态规则，荧光较弱，且着色均匀.不同浓度的TW9183和吉非替尼可使部分细胞出现致密浓染或碎块状致密浓染，表明药物作用后细胞凋亡增加.其中，Hela细胞凋亡效果较明显，其结果如图6所示.图6中：A～E分别为0，2，4，8，16μmol·L－1的TW9183，F为16μmol·L－1的吉非替尼（×100）.

2.6 TW9183对肿瘤细胞caspase-3蛋白表达的影响

细胞凋亡有多种因素参与，其中，caspase－3蛋白酶在凋亡信号传导中起核心作用［7］.它在细胞内以无活性的前体（酶原）形式存在，激活后导致凋亡的发生.TW9183对Hela，A549和SMMC－7721细胞caspase－3蛋白表达的影响，如图7所示.由图7可知：不同浓度的TW9183作用3种肿瘤细胞48h后，随TW9183浓度的增大，caspase－3蛋白相对分子量32kD 的酶原表达量逐渐减少，17kD 的活性成分表达量逐渐增加，提示TW9183作用于肿瘤细胞后可激活caspase－3，发挥促进肿瘤细胞凋亡的效应.

图6 TW9183对Hela细胞 凋亡的影响Fig.6 Effects of TW9183on nuclear apoptosis in Hela cells

图7 TW9183对Hela、A549和SMMC－7721细胞caspase－3蛋白表达的影响Fig.7 Effects of TW9183on expression of caspase－3 protein in Hela，A549and SMMC－7721cells

2.7 TW9183对肿瘤细胞周期分布的影响

与阴性对照组相比，各浓度TW9183作用后，肿瘤细胞的G2／M 期细胞比率均有不同程度的增加，且该结果呈现剂量依赖性，表明TW9183主要诱导肿瘤细胞阻滞于G2／M 期；而吉非替尼主要将细胞周期阻滞于G0／G1 期，二者阻滞的细胞周期不同，有待进一步研究.

3 结论

文中合成的目标化合物是一种新的喹啉衍生物.红外光谱、碳谱、氢谱、电喷雾质谱及元素分析结果证实该化合物与所设计的TW9183结构相符，其收率达到85%.此法操作简便，原料便宜易得，反应效率高，易于进行工业化生产.

细胞异常增殖、迁移以及细胞去分化都是肿瘤形成的重要原因［8］.通过MTT、平板克隆、划痕实验等证实，TW9183对Hela，A549和SMMC－7721细胞的增殖、迁移均有一定的抑制作用.Hoechst 33342染色、Western blot和流式细胞术还表明：TW9183不同程度地促进这3种细胞的凋亡，将细胞周期阻滞在G2／M 期.所有实验均证实TW9183较吉非替尼表现出更强的体外抗肿瘤活性，但其抗肿瘤作用机制及体内动物实验还需后续继续研究.

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