坦布苏病毒MM1775株反向遗传操作系统的建立

闫大为，吴晓刚，李雪松，石 迎，冯琳琳，崔宏锐，李国新，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

坦布苏病毒MM1775株反向遗传操作系统的建立

闫大为，吴晓刚，李雪松，石 迎，冯琳琳，崔宏锐，李国新，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

本研究将坦布苏病毒 MM1775 株全基因组分 3 段克隆，获得 3 个重组质粒，利用融合 PCR方法扩增得到5'端含有 T 7 启动子的病毒全长 cDNA，经体外转录得到感染性的 RNA，将 RNA 转染 DF-1 细胞，48 h 后出现细胞病变。当细胞病变达到 90%，将细胞上清接种 DF-1 细胞，72 h 后进行间接免疫荧光（indirect immunofulorescence，IFA）和RT-PCR 鉴定，结果表明拯救病毒成功。序列测定结果显示，拯救毒的全基因组序列与亲本毒完全一致，表明MM1775反向遗传操作系统构建成功，为进一步研究坦布苏病毒致病性等相关分子机制奠定了基础。

坦布苏病毒；MM1775；反向遗传操作系统

2010年，我国首次爆发了鸭坦布苏病毒病，该病主要表现为产蛋鸭产蛋率骤降，并伴有高热、食欲下降、运动障碍等临床症状，严重时可导致鸭死亡，给我国鸭养殖业造成了严重的经济损失［1-4］。到目前为止，已从鸭、鹅、鸡、鸽子、麻雀和蚊子体内分离得到多株鸭坦布苏病毒［5-11］，可见该病毒感，可引起小鼠出现神经症状并可能造成死亡［12］。鸭养殖场工人的被检血清呈现抗坦布苏病毒阳性，被检工人的咽拭子中，有47.7% 能检测到病毒RNA［13］，表明鸭坦布苏病毒具有潜伏感染人的几率。

1955年，研究人员从马来西亚库蚊体内分离到第1株坦布苏病毒分离株（MM1775株）［14］，随后几十年陆续从蚊子体内分离到多株坦布苏病毒，但很少有动物感染该病毒的报道［15-17］。目前对早期坦布苏病毒蚊体分离株在不同动物体内的复制能力，对动物的致病性及在动物间的传播能力等生物学特性缺乏足够的研究，阻碍了我们对坦布苏病毒致病性的深入了解和认识。利用病毒反向遗传操作系统，可以在分子水平对病毒进行改造，为研究坦布苏病毒的分子致病机制等提供技术平台。

1 材料和方法

1.1 病毒核酸、菌种和细胞 保存在Trizol 中的坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）MM1775 株核酸购买自北京中原合聚经贸有限公司；E.coli DH5α购自北京全式金公司；DF-1 细胞和抗鸭坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体（1F5）由本实验室保存。

1.2 主要试剂 DMEM培养液、胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司； RNAisoPlus、ATP、pSIMPLE19 EcoR V/BAP Vector、EcoR I、Kpn I、EcoR V、Not I等限制性核酸内切酶均购自TaKaRa公司；PfuUltraII Fusion HS DNA 聚合酶购自 Agilent公司；mMESSAGEmMACHINE®T7 Kit购自 Ambion公司；Lipofectamine LTX & Plus Reagent、Super Script III反转录酶购自Invitrogen公司；Opti-MEM购自Life technologies；DNA 凝胶回收试剂盒、质粒提试剂盒购自Axygen公司；T4 PNK购自NEB公司。

1.3 病毒 RNA 的提取和RT-PCR 扩增 按照Trizol说明书要求提取坦布苏病毒MM1775株的RNA，以7条MM1775 株特异性反转录引物的混合液作为反转录引物（表1），经Super Script III反转录酶反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，以10对PCR引物用PfuUltra II Fusion HS DNA 聚合酶扩增得到10段两两重叠的PCR产物。

1.4 重组质粒的构建 经PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶扩增得到的cDNA，末端没有磷酸基团，需经T4 PNK磷酸化后，与pSIMPLE 19载体16℃过夜连接，然后将连接反应液按常规方法转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞中。将 100 μ L 菌液均匀涂在含有Amp、X-Gal和IPTG的LB平板上，37℃培养12 h，挑取白色单个菌落，接种在4 mL含Amp液体L B培养基（Amp+）中，37℃培养12 h。进行菌液PCR，将阳性克隆送上海桑尼生物公司测序。利用质粒提取试剂盒提取序列正确的质粒，并进行浓度测定。

1.5 病毒基因组分段克隆 将上述10段PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外照胶仪下切割目的条带，利用胶回收试剂盒进行纯化回收，克隆至pSIMPLE 19 载体上得到序列正确的重组质粒：1-1174-pSIMPLE、1106-2384-pSIMPLE、2281-3434-pSIMPLE、3352-4567-pSIMPLE、4513-5874-pSIMPLE、5797-7012-pSIMPLE、6937-8078-pSIMPLE、8059-9087-pSIMPLE、9061-9961-pSIMPLE和9941-11001-pSIMPLE 。对MM1775 株基因组序列进行单一限制性酶切位点分析，选取6237（EcoR V）、8283（KpnI）、9087（EcoR I）位点引入其他酶切位点后进行亚克隆。分别以得到的重组质粒为模板，经融合PCR扩增并克隆得到重组质粒1106-3827-pSIMPLE。同样以分段克隆质粒为模板经融合PCR扩增得到 3352-6237 -pSIMPLE（3'端引入NotI 酶切位点）、6237-8283 -pSIMPLE（3'端引入多克隆位点 EcoRV和 NotI）、8059-9087-pSIMPLE、9061-11001-pSIMPLE（3'端引入NotI位点），对重组质粒和目的片段依次进行双酶切、纯化回收目的片段、连接、转化等亚克隆步骤得到重组质粒3352-11001-pSIMPLE。

1.6 TMUV MM1775株全长cDNA的扩增 以1-1174-pSIMPLE、1106-4567-pSIMPLE和3352-11001-pSIMPLE质粒为模板进行PCR、电泳、割胶回收得到MM1775-1-1174、MM1775-1106-456和MM1775-3549-11001，以MM1775-1-1174和（5'端添加保护性碱基和T7启动子序列）和MM1775-3827R为上下游引物（表1）经融合PCR扩增得到MM1775-T7-3827。以MM1775-T7-3827和MM1775-3549-11001两个回收后的DNA片段作为模板经过2轮PCR得到MM1775-T7-11001。反应体系：5μL10×pfu Buffer、5 μL 2.5mmol/L dNTP Mix、1 μL Pfu Polymerase、39 μL等摩尔比的 MM1775-T7-3827和MM1775-3549-11001。反应条件：94℃预变性2min；（94℃，30s；68℃，12min）×15个循环，68℃延伸10min。以上一轮PCR反应液为模板，反应体系：5 μLdNTP Mix （2.5 mmol/L） dNTP Mix、5 μ L10×pfu Buffer、1μL pfuDNA聚合酶、2μL第一轮PCR反应液、2μL上游引物、2μL下游引物，H2O补齐至50μL。反应条件如下:94℃预变性2min；（94℃，30 s；68℃，16 min）×30个循环；68℃延伸10 min。进行凝胶核酸电泳后，回收长度为11 001 bp的目的片段。

表 1 MM1775基因组分段 PCR 引物Table 1 Primers for RT-PCR in this study

1.7 转染 以5'端添加T7启动子序列的 MM1775株全长cDNA为模板，用mMESSAGEmMACHINE®T7 Kit试剂盒对 cDNA 进行体外转录，获得具有感染性的RNA；经氯化锂沉淀、纯化后，利用Lipofectamine LTX & Plus Reagent将感染性RNA转染至DF-1细胞。转染后观察转染孔细胞是否出现病变，当病变达到90%时收集细胞上清接种新的DF-1细胞，并将拯救的病毒命名为vMM1775。

1.8 rMM1775 IFA检测 接种后72 h收集细胞上清，对病变细胞进行IFA检测（indirect immunoinfluscent assay， IFA）耐药率相对较高:4%多聚甲醛固定30min；PBS洗涤3次，每次3min（下同）；0.5%TritonX-100通透10min，PBS洗涤；1%BSA封闭30 min，PBS洗涤；抗坦布苏E蛋白单克隆抗体（1F5），37℃孵育1h，PBS洗涤；400倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1h，PBS洗涤；倒置荧光显微镜下观察有无特异性荧光。

1.9 拯救病毒rMM1775分段PCR鉴定 对上述收集的细胞上清进行RNA抽提，分段RT-PCR后，对目的条带回收，经测序及序列拼接后，得到rMM1775的全基因组序列。

图 1 MM1775 株基因组全长扩增电泳图Fig. 1 Amplified fragment of MM1775 genome

2 结果

2.1 DTMUV MM1775 株全长cDNA 的扩增结果 以MM1775-1-1174和MM1775-1106-4567为模板，MM1775-T7-1F（5'端添加保护性碱基和T7启动子序列）和MM1775-3827R为上下游引物经融合PCR扩增得到MM1775-T7-3827。以3352-11001-pSIMPLE为模板，MM1775-3352F和MM1775-11001R为上下游引物扩增得到MM1775-3352-11001。以MM1775-T7-3827和MM1775-3352-11001为模板经两轮融合PCR后，得到5'端含有T7启动子序列的MM1775株全基因组cDNA（图1）。

2.2 拯救病毒rMM1775致DF-1细胞病变将感染性RNA转染DF-1细胞后48h，部分细胞出现病变，表现为细胞皱缩、变圆、脱落，有些形成合胞体（图2），至84 h，细胞病变达到90%，拯救的病毒命名为rMM1775。

2.3 rMM1775 IFA鉴定结果 将细胞病变达到90%的转染孔上清液接种DF-1细胞后72h，细胞仍然出现病变，对细胞进行IFA，感染细胞呈现特异性绿色荧光，而阴性对照孔中并没有出现特异性绿色荧（图3）。

2.4 rMM1775基因组分段RT-PCR和序列结果 对拯救病毒rMM1775进行RNA抽提，经RT-PCR鉴定（图4）及序列测定显示，rMM1775的序列和亲本MM1775株病毒序列一致。

综上可见，TMUV Marker （DL5000）MM1775株病毒全长cDNA拯救病毒成功。成功建立TMUV MM1775株反向遗传操作系统。

图 2 rMM1775 致 DF-1 病变（转染后 48 h）Fig. 2 CPE of DF-1 cells infeeted with rMM1775（48 h post-transfection）

图3 拯救病毒rMM1775 IFA 结果Fig. 3 IFA result of rMM1775 strain

图4 拯救病毒 rMM1775 株基因组 RT-PCR鉴定结果Fig. 4 RT-PCR result of rMM1775 strain genome

3 讨论

坦布苏病毒属于黄病毒科、黄病毒属，该属的病毒全基因组cDNA全长或部分克隆存在不稳定性的特点，在大肠杆菌中容易发生突变、重排等变异，这些变异会对病毒的复制、转录等过程产生重要影响，从而难以得到黄病毒的感染性克隆［18］。导致这种现象的可能原因是克隆的目的片段对大肠杆菌具有毒性，可使大肠杆菌死亡或病毒产生适应性突变［19］。

目前，黄病毒的反向遗传操作系统的建立主要有两种方法：一种是将病毒的全基因组序列克隆至含有真核启动子的载体中，将重组质粒直接转染至细胞或动物体内获得感染性cDNA［20］；另一种是将病毒的全基因组序列和启动子序列一起克隆至低拷贝质粒中，经体外转录后获得病毒的感染性RNA［21］，但是用该方法构建的鸭坦布苏病毒JXSP株感染性cDNA具有多处随机突变［22］，由此cDNA克隆拯救得到的病毒恢复株与原毒株序列不完全相同，这不利于对病毒致病性的研究。

本研究通过分段克隆的方式构建出3个涵盖全基因组序列的重组质粒，然后以此为模板，采用高保真DNA聚合酶直接进行PCR扩增得到序列完全没有改变的病毒基因组的全长cDNA，并以此为基础，首次建立了鸭坦布苏病毒MM1775株的反向遗传操作系统，由此系统拯救得到的病毒恢复株不含有任何突变，生物学特性与原毒株一致。

在此基础上，可通过研究坦布苏病毒MM175株拯救毒rMM1775与鸭坦布苏病毒FX2010株对不同动物的致病性差异，再将两株病毒的反向遗传操作系统［23，24］相互结合，通过替换基因序列，构建重组病毒，研究相关氨基酸变异对病毒致病性的影响，从而进一步阐明坦布苏病毒的致病性差异的分子机制。

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ESTABLISHMENT OF REVERSE GENETICS SYSTEM FOR TEMBUSU VIRUS STRAIN MM1775

YAN Da-wei， WU Xiao-gang， LI Xue-song， SHI Ying， FENG Lin-lin， CUI Hong-rui，LI Guo-xin， LI Ze-jun
（Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241，China）

The cDNA of Tembusu virus strain MM1775， were inserted segmentally into 3 plasmids， by PCR amplification， cloning and sub-cloning methods. The full-length cDNA， with T7 promoter sequence added at 5 'ends， was amplified by infusion-PCR using the recombinant plasmids as templates and transfected in vitro to produce the virus RNA， which was then transfected into DF-1 cells to rescue virus. Detectable cytopathic effect （CPE） was found at 48 hours post-transfection. To test the rescued virus， fresh DF-1 cell were infected with the supernatant of transfected-cell culture when 90% transfected-cells showed CPEs. Specific green fluorescence could be detected in the newly infected cells by indirect immuno fluorescence （IFA） and specic RT-PCR products could be amplified from the supernatants at 72 hours post-infection， suggesting the success of MM1775 rescue. Sequence analysis confirmed the rescued virus have no unexpected nucleotide change comparing with its parental virus. The establishment of the reverse genetics system of MM1775 settled the foundation for further study on the molecular basis of the pathogenicity of Tembusu virus.

Tembusu virus； MM1775； reverse genetics system

S852.659.6

A

1674-6422（2015）04-0008-06

2015-04-07

国家自然基金面上项目（31172332）

闫大为，男，博士研究生，预防兽医学专业

李泽君，E-mail:lizejun@shvri.com.cn