3份胡椒属种质花粉离体萌发研究①

伍宝朵++郝朝运+胡丽松++范睿++邬华松

摘 要 以海南蒟、大叶蒟和球穗胡椒的花粉为材料，研究了不同培养基和采样时间对花粉萌发率的影响。结果表明：3种胡椒种质花粉的最佳萌发条件分别为100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+600 mg/L Ca（NO3）2、100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+300 mg/L Ca（NO3）2和100 g/L蔗糖+200 mg/L硼酸+300 mg/L Ca（NO3）2。ME3培养基抑制海南蒟和球穗胡椒花粉萌发，蔗糖、硼酸和Ca2+的协同作用可以提高胡椒花粉萌发率，硼酸的浓度需要控制在一定范围内（≤200mg/L），300～600 mg/L的Ca2+浓度对花粉萌发率影响不显著。同时，本研究发现，9：00～10：00或16：30是收集这3种胡椒种质花粉进行杂交试验的较佳时间。

关键词 胡椒属 ；花粉；离体萌发 ；远源杂交

分类号 S339.3+2

胡椒（Piper nigrum L.）是胡椒科（Piperaceae）胡椒属（Piper）多年生常绿藤本植物，是世界重要的热带香辛料作物[1-2]。在医学工业中胡椒被用作健胃剂、解热剂和支气管粘膜刺激剂等；食品工业被用作抗氧化剂、防腐剂和保鲜剂等[3]。中国胡椒主要分布在海南、云南、广东、广西和福建等省（区），种植面积超过3万hm2，年产约2.7万t，均居世界第五，其中海南是胡椒主产区，种植面积和产量均占全国90%以上[4]。

胡椒原产印度西高止山脉，经历了2000多年的驯化，目前广泛种植于中国、印度、越南、柬埔寨、巴西等40多个国家，其中以印度的栽培品种最多[5]。胡椒育种的目标除高产优质和适应性良好外，还要针对危害胡椒生产的首要病害（胡椒瘟病）进行。但有关胡椒育种方面的资料有限，近年除印度、中国、马来西亚外，其它胡椒主产国很少有相关报道[5]。中国至今引种并培育了一批胡椒栽培种质，如云选1号、班尼约尔1号、柬埔寨小叶种、73-F-5、柬×印23等，总体来说，中国胡椒品种相对较少[6-7]，导致胡椒栽培品种遗传背景比较狭窄，对开展胡椒育种工作不利。胡椒野生种叶间距、叶片、花序和果实大小等存在很大的表型变异[7]，且野生种质中具有抗病等多种优异基因资源，通过远源杂交合理利用野生种质优异基因资源进行胡椒杂交育种，是增加变异的有效手段。

花粉是种子植物的雄性配子体，在有性繁殖中扮演着重要角色。明确胡椒野生种质花粉萌发条件对指导胡椒远缘杂交育种具有重要理论和现实意义。目前，仅Shang等[8]对巴西野生种哥鲁波利胡椒的花粉萌发进行了初步研究，其他还未见报道。海南蒟产于广东南部、海南及广西南部至西南部；全株可入药，花穗长且密集；大叶蒟是中国的特有植物，分布于广东、海南等地的树上、密林中或石上，花单性，雌雄异株，具有果穗较长的特点；球穗胡椒是纤细攀援藤本，生于亚热带山谷密林或疏林中、攀援于树上，花穗密集。本研究对海南蒟、大叶蒟和球穗胡椒3种野生胡椒种质的花粉萌发培养基培养体系和采样时间进行了研究，探讨了影响胡椒花粉萌发的因素，为胡椒远源杂交工作的开展提供参考，以促进我国胡椒产业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为海南蒟（Piper hainanense）、大叶蒟（Piper laetispicum）、球穗胡椒（Piper thomsonii），均来自于中国热带农业科学院香料饮料研究所内的农业部万宁胡椒种质资源圃。

1.2 方法

以雄花开放一半以上的花穗为研究对象，用于萌发条件摸索的花粉于晴天9：00采集，并用无菌水反复冲洗，收集冲洗液。将培养基和花粉收集液滴加到带凹槽的载玻片上，28℃培养5 h，花粉离体萌发以花粉管长于花粉直径为标准。在Olympus（BX51）显微镜下观察计数，每次每个处理分别取3个固定大小的视野统计，单次统计花粉数不少于60个，萌发率（%）=（萌发花粉总数/总花粉数）×100。

1.2.1 不同培养基对花粉萌发率的影响

在不同浓度蔗糖（50、100、200 g/L）的基础上，比较1/2 ME3、ME3[9]的作用，以蔗糖培养基为对照。在不同浓度蔗糖（50、100、200 g/L）的基础上，分别添加100、200、300 mg/L H3BO3，以及300、600 mg/L Ca（NO3）2，分析硼酸和Ca2+浓度增加对花粉萌发的影响。对3种胡椒属种质进行花粉离体培养，调查花粉离体萌发率，选取较优培养基组合。

1.2.2 不同取样时间对花粉萌发率的影响

依据试验选取最佳培养基，对不同取样时间花粉进行离体培养。在3种胡椒属种质盛花期分别于8：00，10：00，14：30，16：30收集花粉进行离体培养，观察各种胡椒不同取样时间花粉萌发情况并进行统计，重复3次。

1.2.3 数据处理

试验数据采用spss软件进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 培养基对花粉萌发率的影响

分别以50、100、200 g/L蔗糖培养基离体培养3种胡椒种质花粉，都有一定的萌发，萌发率介于2.23%～14.54%（表1）。在50 g/L蔗糖培养基中，大叶蒟、海南蒟和球穗胡椒花粉萌发率分别为2.23%、14.54%和6.82%；在100g/L蔗糖培养基中，3种胡椒种质花粉萌发率分别为1.94%、9.39%和9.50%；而在200 g/L蔗糖培养基中，大叶蒟和海南蒟花粉萌发受到抑制，萌发率低于1%，球穗胡椒花粉有一定的萌发（6.51%）。其中以海南蒟在50 g/L蔗糖培养基中萌发率最高。在蔗糖基础上添加ME3的研究表明，蔗糖和1/2 ME3、ME3互作条件下，只有大叶蒟有一定萌发，且在50 g/L蔗糖+1/2 ME3培养基中萌发率较高（19.58%），海南蒟和球穗胡椒花粉在蔗糖培养基添加1/2 ME3、ME3基本培养基中没有萌发，萌发率低于1%。

设置蔗糖+100 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2和蔗糖+100 mg/L H3BO3+600 mg/L Ca（NO3）2进行Ca2+浓度对胡椒花粉萌发影响的研究（表2）。在50 g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3培养基中，将Ca（NO3）2浓度由300 mg/L提高至600 mg/L时，大叶蒟花粉萌发率变化不大，海南蒟花粉萌发率则由28.47%增加至47.70%，球穗胡椒花粉萌发率由41.26%降低至27.88%。在100 g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3培养基中，随Ca（NO3）2浓度提高，大叶蒟花粉萌发率由47.22%增加至65.15%，海南蒟花粉萌发率由62.20%降低至46.66%，球穗胡椒花粉萌发率由31.60%降低至20.44%。在200 g/L蔗糖+100 mg/L H3BO3培养基中，随Ca（NO3）2浓度提高，大叶蒟花粉萌发率由17.97%增加至21.12%，海南蒟花粉萌发率由43.40%降低至33.35%，球穗胡椒花粉萌发率由16.71%降低至13.32%。总体而言，Ca2+浓度由300 mg/L增加至600 mg/L时，3种胡椒花粉萌发率没有显著性变化；同时发现，添加了硼酸和Ca2+的蔗糖培养基比单一的蔗糖培养更能促进胡椒花粉的萌发。说明在蔗糖培养基基础上，硼酸和Ca2+的协同作用可以显著提高胡椒花粉萌发率，但是在一定浓度条件下（300～600 mg/L），改变Ca2+浓度对花粉的萌发率没有显著影响。

以蔗糖+100 mg/L H3BO3+300 mg/L Ca（NO3）2为对照，研究增加硼酸浓度对胡椒花粉萌发影响（表3）。结果表明，在50 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培养基中，随硼酸浓度的提高，大叶蒟花粉萌发率由39.23%降低至13.96%；海南蒟花粉萌发率由28.47%提高至32.42%，又降低至16.69%；球穗胡椒花粉萌发率由41.26%提高至48.11%，又降低至25.80%；表明在该培养基中，硼酸浓度由100 mg/L增加至300 mg/L时，3种胡椒花粉萌发率显著降低。在100 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培养基中，随硼酸浓度的提高，大叶蒟花粉萌发率由47.22%降低至1.19%；海南蒟花粉萌发率由62.20%降低至22.95%；球穗胡椒花粉萌发率由31.60%提高至55.12%，又降低至20.69%；结果同样表明，在该培养基中，随硼酸浓度增加，3种胡椒花粉萌发率显著降低。在200 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培养基中，随硼酸浓度的提高，大叶蒟花粉萌发率由17.97%增加至32.85%，又降低至18.70%；海南蒟花粉萌发率由43.40%降低至28.69%，又提高至31.47%；球穗胡椒花粉萌发率由16.71%提高至24.99%，又降低至18.16%；表明在该培养基中，硼酸浓度由100 mg/L增加至300 mg/L时，海南蒟和球穗胡椒花粉萌发率没有显著性变化，而大叶蒟花粉萌发率在200 mg/L硼酸浓度比对照和300 mg/L硼酸浓度时有显著提高。

2.2 取样时间对花粉萌发率的影响

3种胡椒种质花粉及萌发情况如图1所示，花粉粒在萌发前、后都是圆形，花粉形态与哥鲁波利胡椒不同[8]。在10：00和14：30收集的3种胡椒种质花粉萌发率不高（图2）；大叶蒟和球穗胡椒在10：00以前和16：30收集的花粉萌发率显著高于其他时间点，而海南蒟花粉在10：00以前萌发率较高，10：00之后萌发率不高。从3种胡椒种质在5个时间点收集平均花粉数量来看，上午8：00收集花粉量最少，其他时间收集花粉量偏多。

3 讨论

蔗糖、硼酸和钙是花粉萌发和花粉管伸长的必需物质，也是花粉离体萌发培养基的主要成分[10]。ME3基本培养基中含有多种矿质元素，在花粉管形成过程中起重要作用[11-12]。因此本研究选用了蔗糖、硼酸、Ca（NO3）2和ME3培养基作为胡椒花粉离体萌发的培养基组成，首次明确了3种胡椒种质（大叶蒟、海南蒟和球穗胡椒）花粉最佳萌发条件分别为100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+600 mg/L Ca（NO3）2、100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+300 mg/L Ca（NO3）2和100 g/L蔗糖+200 mg/L硼酸+300 mg/L Ca（NO3）2。在花粉离体萌发中蔗糖的作用是提供渗透压和花粉管形成需要的能量，3种胡椒种质花粉在蔗糖培养基中都能萌发，但是萌发率不高。ME3培养基含有多种矿质元素，可以促进花粉管的萌发[13]。本研究中大叶蒟花粉在添加了ME3的蔗糖培养基中萌发率有一定提高，但海南蒟和球穗胡椒花粉萌发被抑制，萌发率小于1%，原因可能是在ME3培养基中含有矿质元素的浓度抑制了海南蒟和球穗胡椒花粉萌发，该结论有待实验的进一步证明。本实验结果表明，ME3培养基不适合用于大叶蒟、海南蒟和球穗胡椒花粉离体萌发。

Ca2+可通过多种途径影响花粉萌发和花粉管生长[14]。硼可以参与花粉管顶端细胞壁的形成，促进花粉萌发和花粉管生长[15]。本研究也证明，蔗糖培养基中添加硼酸和Ca（NO3）2使胡椒花粉萌发率显著提高，因此蔗糖、硼酸和Ca（NO3）2的协同作用可以提高胡椒花粉萌发率。通过硼酸浓度实验表明，在胡椒花粉萌发中硼酸的浓度需要控制在一定范围内（≤200 mg/L），当硼酸浓度过高时对3种胡椒花粉萌发都会起抑制作用。在50 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2和100 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培养基中，当硼酸浓度达到300 mg/L时，3种胡椒花粉萌发率都显著降低，说明含有50 g/L蔗糖和100 g/L蔗糖的培养基中，硼酸浓度过高（≥200 mg/L）对胡椒花粉萌发不利；在200 g/L蔗糖+300 mg/L Ca（NO3）2培养基中，随硼酸浓度的变化，海南蒟和球穗胡椒的花粉萌发没有显著性变化，表明蔗糖浓度达到200 g/L时，硼酸的浓度对海南蒟和球穗胡椒的花粉萌发没有影响。本研究发现，在蔗糖+100 mg/L硼酸培养基中，将Ca（NO3）2浓度由300 mg/L 增加至600 mg/L时，Ca2+浓度改变对花粉的萌发率没有显著影响。

Shang等[8]通过对巴西野生种哥鲁波利胡椒的观察，发现该种质花粉在9：00散粉，散粉2～8 h内萌发率较高。本研究为利于田间操作，以采集雄花开放一半以上的花穗为对象，分5个时间点取样，研究显示在10：00和14：30收集的胡椒花粉萌发率不高。10：00以前和16：30花粉萌发率偏高，但是上午8：00收集花粉量最少。因此选择本研究中3种胡椒作为父本进行杂交试验在9：00～10：00或16：30以后，花粉萌发效果较好。印度班尼约尔研究站在花粉刚刚散粉（傍晚）后进行胡椒栽培品种杂交试验，与Shang等[8]研究结果不同，原因可能是试验选用的种质不同，不同国家的气候差异所致。

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