邻苯二甲酸二异壬酯致小鼠肝组织氧化损伤的研究

陆 杰，代园园，罗 慧，龚金锋，王绪杨，武 阳，，杨 旭，马 萍，*（.湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 43700；.华中师范大学生命科学学院环境生物医学实验室，湖北 武汉 430079）

邻苯二甲酸二异壬酯致小鼠肝组织氧化损伤的研究

陆 杰1，代园园1，罗 慧1，龚金锋1，王绪杨1，武 阳1，2，杨 旭2，马 萍1，2*（1.湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100；2.华中师范大学生命科学学院环境生物医学实验室，湖北 武汉 430079）

研究邻苯二甲酸二异壬酯对小鼠肝细胞的氧化损伤.以昆明小鼠为受试动物，随机分为5组，包括1个阴性对照组、4个邻苯二甲酸二异壬酯染毒组，染毒组按0.5，5，50，500mg/kg4个剂量水平，灌胃染毒小鼠14d.以肝组织匀浆测定活性氧（ROS）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的含量；以肝组织细胞测定DNA-蛋白质交联（DPC）系数.随着邻苯二甲酸二异壬酯染毒剂量的升高，肝组织的ROS、MDA、8-OHdG含量和DPC系数逐渐上升，GSH含量逐渐降低，各指标呈一定的剂量-效应关系.染毒剂量为50mg/kg时， ROS、GSH、8-OHdG含量和DPC系数差异有统计学意义（P＜ 0.05， P＜ 0.01）；染毒剂量为500mg/kg时，上述指标差异均有统计学（P＜ 0.05，P＜ 0.01）.同时对小鼠肝组织形态进行光镜观察，结果表明，随着染毒剂量的加大，小鼠肝细胞的病理损伤越严重.较高剂量（≥50mg/kg）的邻苯二甲酸二异壬酯能造成小鼠肝组织的氧化损伤.

活性氧；还原型谷胱甘肽；丙二醛；8-羟基脱氧鸟苷；DNA-蛋白质交联；氧化损伤

邻苯二甲酸二异壬酯（DINP）属于邻苯二甲酸酯类化合物，是一种新型替代增塑剂，现广泛应用于各类软质聚氯乙烯产品、橡胶产品和涂料的工业生产中.作为邻苯二甲酸酯类物质中重要的类型，DINP可以通过皮肤接触、进食、饮水和空气吸入等多种途径进入人体［1-2］，对于DINP毒性的研究已经受到环境科学学者们的广泛关注.Boberg等［3］研究发现DINP的剂量高于300mg/（kg·d）时对Wistar大鼠有抗雄性激素作用，具有生殖毒性.Kaufmann等［4］研究了DINP的致癌性，发现DINP在大鼠体内能诱导过氧化物酶的生成，进而诱导肝肿瘤的产生.Saillenfait等［5］对Sprague-Dawley大鼠进行DINP的口服染毒实验，发现DINP能导致其胚胎发育毒性和产后畸形.2005年，欧盟规定儿童可放进口中的玩具及儿童护理用品，其塑料所含的3类邻苯二甲酸盐（DINP、DIDP及DNOP），浓度不得超过0.1%［6］.有关邻苯二甲酸酯类物质的毒理学研究己有诸多报道，但有关DINP的毒性机理研究相对较少，国内未见相关报道.DINP在啮齿类动物和人体内的吸收、分布、代谢和排泄已经得到阐明［7］，但国内外有关DINP氧化损伤的研究并不多见，大都是以研究人的体液（如尿液，乳汁，唾液，血清等）的氧化代谢物为主［8-9］.本研究以SPF级雄性昆明小鼠为实验材料，采用DINP体内染毒方法，通过检测其肝组织匀浆测定活性氧、还原型谷胱甘肽、丙二醛、8-羟基脱氧鸟苷的含量，并以肝组织细胞测定DNA-蛋白质交联系数的变化以及通过肝组织切片观察，探讨DINP对小鼠肝细胞氧化损伤的机制，为全面探讨DINP的毒性效应及分子机制提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器与试剂 Power wave XS酶标仪（美国Bio-Tek仪器有限公司），FLx 800荧光酶标仪（美国Bio-Tek仪器有限公司），F-4500型荧光分光光度计（日本日立公司），5415R低温冷冻离心机（德国Eppendorf公司），RM2245切片机（德国LEICA公司），HH-42三用电热恒温水箱（长源实验仪器厂，北京）；DCFH-DA荧光染料（＞99.9%，Sigma公司），蛋白酶K（Sigma公司），小鼠8-羟基脱氧鸟苷ELISA检测试剂盒（济南朋远生物技术有限公司，济南），还原型谷胱甘肽试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京），Hoechst33258荧光染料（Sigma公司），三羟基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCL，分析纯，Amresco分装）， 5，5′-二硫代二硝基苯甲酸（DTNB，分析纯，国药集团化学试剂有限公司），硫代巴比妥酸（TBA，分析纯，国药集团化学试剂有限公司），邻苯二甲酸二异壬酯（DINP，≥99.6%，Sigma公司）.

1.1.2 实验动物 选用湖北省实验动物研究中心提供的SPF级雄性昆明小鼠30只（合格证号:No. 42000600001226），体重为（33.15±1.15）g，饲养1周后实验，实验动物使用许可证号:SYXK（鄂）2013-0071.实验过程中，小鼠饲养于无菌笼内，保持温度在20～25℃内，笼内相对湿度为50%～70%，以商业鼠粮饲养小鼠，及时补充饮用水，并避免其接触其它干扰致病源，小鼠可自由进食进水.

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组和染毒 国际所规范的DINP可接受的日摄入量（ADI）上限在0.02～0.14mg/kg之间.在ADI水平的基础上，Lington等［10］研究表明，DINP的未观察到有害效应的水平（NOAEL）为15mg/kg，而Moore［11］的研究表明DINP的NOAEL可达88mg/kg.因此，考虑到DINP剂量的不确定性，模拟评估DINP最大的风险剂量，并参照Gray等［12］和McKee等［13］文中提及的500mg/kg作为本实验最高的染毒剂量， 0.5mg/kg作为本实验最低的染毒剂量.

30只昆明小鼠随机分为5组，包括1个阴性对照组、4个DINP染毒组，每组6只.染毒组的染毒剂量分别为0.5，5，50，500mg/kg，以生理盐水稀释成0.05，0.5，5，50mg/mL4种浓度的使用液，稀释过程中加与DINP等量的吐温80助溶；因吐温80只是作为DINP的助溶剂，量很小，对生物体无毒无副作用，所以阴性对照组只是给予生理盐水.稀释液现用现配，使用时在旋涡混悬仪上充分混匀.均经口灌胃给予，灌胃量为10mL/kg，每天1次，连续染毒14d，分别于实验前称小鼠体重.

1.2.2 肝组织切片的制备和观察 染毒结束后用颈椎脱臼法处死小鼠，立即取肝组织，肝组织用4%的多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡切片，HE染色，普通光学显微镜下观察肝组织的病理组织学变化.

1.2.3 肝组织匀浆和悬液的制备 将肝组织在冰冷的PBS（pH7.5）中漂洗，滤纸拭干，分成2部分，一部分肝组织加PBS制成10%匀浆液，低温离心后取上清，用于ROS、GSH、MDA和8-OHdG的检测.另一部分肝组织剪成糜状，过滤后将滤液离心去上清，再用 PBS重悬细胞，用于DPC系数的检测.

1.2.4 ROS含量的测定 取上清液4µL，加入396µL PBS作100倍稀释.取100µL稀释液于酶标板中排列，并加入100µL荧光染料DCFA染色，避光反应5min，用荧光酶标仪检测.

1.2.5 蛋白质含量和GSH含量的测定 蛋白质含量按照Folin酚法测定，GSH含量的测定严格按照试剂盒操作说明进行.GSH含量（µmol/ gprot）=［（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）］×标准管浓度×样本稀释倍数÷待测匀浆蛋白浓度（gprot/L）.

1.2.6 MDA含量的测定 取500µL上清液于试管中，并加入2mL0.6%TBA，沸水浴15min.取上清1mL于EP管中，10000×g离心5min.取上清100µL于酶标板中排列，用全波长酶标仪检测，分别在450，532，600nm波长下测定吸光值（以加PBS的为参照），按照公式计算MDA浓度（µmol/ L）=6.45（A532-A600）-0.56A450，式中:A为吸光度.

1.2.7 8-OHdG含量的测定 8-OHdG含量的测定严格按照试剂盒操作说明进行.以0，3，6，12，24，48ng/mL等标准品浓度为横坐标，450nm处OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线来确定样品中8-OHdG的含量.

1.2.8 DPC系数的测定 DPC采用KCl-SDS沉淀法进行检测［14］.首先向样品中加入SDS，使之与DPC及蛋白质结合，然后加入KCl溶液使DPC和蛋白质沉淀，而游离的DNA留在上清液中.将上清液转移后，再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白质，使DPC中的DNA游离出来，用荧光法测定此DNA的含量A（交联DNA）以及原液中DNA的含量B（游离DNA），计算DPC系数η［η= A/（A+B）］.

1.3 统计分析

2 结果

2.1 小鼠体重和肝组织的脏器系数

小鼠体重和肝组织的脏器系数见表1，与对照组比较，各剂量组小鼠体重和脏器系数差异无统计学意义（P ＞ 0.05）.

表1 DINP染毒小鼠的体重和脏器系数（n=6，± s）

表1 DINP染毒小鼠的体重和脏器系数（n=6，± s）

组别 染毒前 染毒后 脏器系数对照组 33.77±0.563 35.25±0.655 0.053±0.001 0.5mg/kg DINP 35.91±0.683 37.38±0.791 0.054±0.002 5mg/kg DINP 34.21±0.631 36.81±0.538 0.052±0.001 50mg/kg DINP 34.43±0.831 35.61±1.385 0.052±0.002 500mg/kg DINP 34.83±0.839 35.11±1.453 0.051±0.003

2.2 小鼠肝组织形态的光镜观察结果

从图1可看出，空白对照组肝组织结构及细胞形态正常，中央静脉及周围放射状肝细胞索清晰，肝索和肝窦比例正常.0.5mg/kg剂量组肝小叶结构完整，肝索和肝窦比例较正常.5mg/kg剂量组肝窦变窄，肝索增宽；肝细胞轻度水肿，体积增大、胞浆疏松化.50mg/kg剂量组肝小叶结构有所紊乱，肝窦宽窄不一，肝索拥挤、扭曲、变形；肝细胞损伤明显，可见病理性核分裂像.500mg/kg剂量组肝小叶结构紊乱；肝索、肝窦结构不清；肝细胞结构破坏，坏死明显.结果表明，随着染毒剂量的加大，小鼠肝细胞的病理损伤越严重.

图1 不同DINP处理组肝组织切片图（10×40， HE染色）Fig.1 Liver slices of different DINP groups （10×40， HE dyed）

2.3 小鼠肝组织ROS含量的变化

ROS含量是反映机体氧化应激水平的指标，由图2可以看出，随着染毒剂量的升高，ROS含量逐渐上升，呈一定的剂量-效应关系.与对照组比较，0.5，5mg/kg剂量组差异无统计学意义，50，500mg/kg剂量组差异有统计学意义（P＜ 0.05）.较高剂量的DINP能造成ROS含量的上升.

图2 不同DINP处理组小鼠肝脏ROS含量Fig.2 ROS content in mouse liver of different DINP groups

2.4 小鼠肝组织GSH含量的变化

图3 不同DINP处理组小鼠肝脏GSH含量Fig.3 GSH content in mouse liver of different DINP groups

GSH是GPx（谷胱甘肽过氧化物酶）催化过氧化物还原的必需底物，可反映机体抗氧化应激的水平，由图3可以看出，随着DINP染毒剂量的升高，GSH含量逐渐下降，呈一定的剂量-效应关系.与对照组比较，0.5，5mg/kg剂量组差异无统计学意义，50，500mg/kg剂量组差异有统计学意义（P＜0.05， P＜0.01）.在较高剂量的DINP作用下，小鼠肝的GSH含量下降明显.

2.5 小鼠肝组织MDA含量的变化

由图4可见，与对照组比较，不同剂量的DINP均能使小鼠肝MDA含量有不同程度的升高.0.5，5，50mg/kg剂量组差异无统计学意义，500mg/kg剂量组差异有统计学意义（P ＜ 0.01），这表明小鼠肝组织的脂膜已受到损伤.

图4 不同DINP处理组小鼠肝脏MDA含量Fig.4 MDA content in mouse liver of different DINP groups

2.6 小鼠肝组织8-OHdG含量的变化

图5 不同DINP处理组小鼠肝脏8-OHdG含量Fig.5 8-OHdG content in mouse liver of different DINP groups

由图5可见， 与对照组比较，不同剂量的DINP能使小鼠肝8-OHdG含量有不同程度的升高.0.5，5mg/kg剂量组差异无统计学意义，50，500mg/kg剂量组差异有统计学意义（P＜ 0.05， P＜0.01），在较高剂量的DINP作用下，小鼠肝脏的8-OHdG含量升高明显.

2.7 小鼠肝脏DPC系数的变化

用KCl-SDS沉淀法检测DPC系数，如图6所示，随着DINP染毒剂量的升高，DPC系数逐渐上升，呈一定的剂量-效应关系.0.5，5mg/kg剂量组差异无统计学意义，50，500mg/kg剂量组差异有统计学意义（P＜ 0.05， P＜ 0.01）.

图6 不同DINP处理组小鼠肝脏DPC系数Fig.6 DPC coefficients in mouse liver of different DINP groups

3 讨论

细胞中ROS含量是反映细胞内氧自由基水平的主要指标［15］.ROS在机体正常代谢状态下含量很低，在胞内信号转导的氧化还原调控中起重要作用［16］；但过量活性氧物质（主要是ROS）的产生会破坏细胞内氧化和抗氧化之间的平衡，从而诱导机体产生氧化应激作用，氧化应激是许多疾病的重要发病机制［17-18］.还原型的GSH可以和ROS结合形成硫代半缩醛，并通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环生成具更强抗氧化作用的抗坏血酸［19］.还原型的GSH是ROS的主要清除剂，它的消耗能反应机体的受氧化损伤程度［20-21］，在评价氧化损伤中具有重要意义.本研究中，随着DINP染毒剂量的升高，ROS含量逐渐上升，GSH含量逐渐下降.与对照组比较，50，500mg/kg剂量组差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）.说明在较高剂量DINP诱导之下小鼠肝组织细胞内产生了过量的ROS，受到ROS攻击，细胞的抗氧化能力下降.

过量的ROS还可使脂质发生过氧化反应，改变细胞膜的结构，使膜成分之间形成交联和聚合，影响膜受体、膜蛋白酶和离子通道的功能，甚至导致细胞死亡.脂质过氧化反应的主要代谢产物是MDA，其水平的高低代表脂质过氧化的强度［22-23］.在本研究中，500mg/kg剂量组MDA含量与对照组差异有统计学意义（p ＜ 0.01），这表明小鼠肝组织的脂膜已受到损伤.

8-OHdG是活性氧自由基攻击DNA 分子中的鸟嘌呤第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物，它是活性氧基团引起的DNA 氧化损伤修饰产物之一.8-OHdG在体内稳定存在，为代谢终产物，且只能通过DNA 氧化损伤途径形成，是目前国际上公认的一种新型评价DNA氧化损伤和氧化应激状态敏感的生物标志物，测定机体8-OHdG含量对评估体内氧化损伤和修复程度有重要意义［24-25］.ROS对细胞的氧化损伤作用还会引起DNA-蛋白质交联，DNA-蛋白质交联难以修复，对参与DNA复制、转录和修复的蛋白质活动起阻碍作用，增加了染色体畸变和姊妹染色单体交换［26］.本研究中，不同剂量的DINP能使小鼠肝8-OHdG含量和DPC系数有不同程度的升高，与对照组比较，50，500mg/kg剂量组差异有统计学意义（P＜0.05， P＜0.01），说明较高剂量的DINP能使小鼠肝8-OHdG的形成以及DNA和蛋白质交联的增多，造成肝组织的DNA损伤.

4 结论

4.1 通过对肝组织进行病理学观察发现，随着DINP染毒剂量的升高，小鼠肝细胞的病理损伤越严重.染毒剂量为50mg/kg时，肝小叶结构有所紊乱，肝窦宽窄不一，肝索扭曲和变形；肝细胞损伤明显，可见病理性核分裂像.染毒剂量为500mg/kg时，肝小叶结构紊乱；肝索、肝窦结构不清；肝细胞结构破坏，坏死明显.

4.2 在较高剂量DINP诱导之下小鼠肝组织细胞内产生了过量的ROS，破坏了自身的氧化与抗氧化平衡，使细胞的抗氧化能力下降，间接引起了小鼠肝组织的脂质过氧化反应和8-OHdG的形成，以及DNA和蛋白质交联的增多，造成肝组织的氧化损伤和病理损伤.

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Oxidative damage of mouse liver tissue induced by diisononyl phthalate.

LU Jie1， DAI Yuan-yuan1， LUO Hui1，GONG Jin-feng1， WANG Xu-yang1， WU Yang1，2， YANG Xu2， MA Ping1，2*（1.College of Basic Medical， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100，China；2.Laboratory of Environment Biomedicine， School of Life Science，Central China Normal University， Wuhan 430079， China）. China Environmental Science， 2015，35（1）：285～290

To investigate the oxidative damages of diisononyl phthalate on mouse liver cells， Kunming mice were randomly grouped into five groups and orally administered with drugs daily for fourteen days； the groups included one solvent control group， four diisononyl phthalate groups. The exposure doses of diisononyl phthalate groups were 0.5， 5， 50 and 500mg/kg respectively. Some liver tissues were then made into homogenates for the measurement of ROS （reactive oxygen species），GSH （glutathione）， 8-hydroxy-2-deoxyguanosine （8-OHdG） and MDA （Malondialdehyde） contents. Meanwhile， DPC（DNA-protein Crosslink） coefficients were detected from liver cell suspension. The liver contents of ROS， MDA， 8-OHdG and DPC coefficients increased gradually in a dose-dependent manner， whereas GSH content decreased accordingly. In the exposure group with the dose of 50mg/kg， ROS， GSH， 8-OHdG contents and DPC coefficients were significantly higher than those of the control group （P＜0.05， P＜ 0.01）； There were significant differences in levels of each biomarker between 500mg/kg group and control group （P＜ 0.05，P＜ 0.01）. Meanwhile liver tissues were sliced for physiological observation，the results showed that tissue injury were severed gradually with the increase of exposure concentration. diisononyl phthalate at certain doses （≥50mg/kg） can induce oxidative stress in mice liver.

reactive oxygen species；glutathione；malondialdehyde；8-hydroxy-2-deoxyguanosine；DNA-protein crosslinks；oxidative stress

X503.22

A

1000-6923（2015）01-0285-06

陆 杰（1992-），男，湖北咸宁人，湖北科技学院本科生，主要从事环境毒理学研究.

2014-04-07

湖北省大学生创新训练计划项目（201310927010）；湖北省自然科学基金项目（2014CFB284）；国家自然科学基金重点项目（51136002）

* 责任作者， 教授， mping68@126.com