硝酸镓对卵巢癌细胞增殖与凋亡的作用

杨红梅

锦州市太和区医院妇产科，锦州 121001

硝酸镓对卵巢癌细胞增殖与凋亡的作用

杨红梅

锦州市太和区医院妇产科，锦州 121001

目的探讨硝酸镓对卵巢癌HO-8910细胞诱导凋亡、抑制增殖的影响。 方法通过对卵巢癌HO-8910细胞培养及干预（硝酸镓不同浓度及时间作用），采用流式细胞仪技术对凋亡细胞进行测定；MTT技术对肿瘤细胞增殖进行测定。 结果 MTT及流式细胞仪检测结果显示，增殖抑制率（80μg/ml）24 h为57.1%、48 h为59.4%、72 h为68.1%；凋亡率5μg/ml为（9.92±1.04）%、10μg/ml为（28.31±1.22）%、20μg/ml为（38.59±1.21）%、40μg/ml为（45.48±1.43）%、80μg/ml为（52.25±2.18）%，硝酸镓对HO-8910细胞作用呈剂量-时间依赖效应。 结论硝酸镓对卵巢癌细胞作用明显，为肿瘤治疗及制备抗肿瘤药物提供新的途径。

硝酸镓；卵巢癌细胞；细胞增殖与凋亡

镓作为金属类药物，在肿瘤方面却未广泛应用，目前主要应用于骨质疏松方面［1-5］。本研究以不同浓度硝酸镓分别体外作用卵巢癌HO-8910细胞，观察对卵巢癌细胞的作用效果，为研发抗肿瘤药物寻找新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢癌HO-8910细胞株（中科院肿瘤研究所）；硝酸镓（Betapharma有限公司）。

1.2 培养细胞

将卵巢癌HO-8910细胞株复苏、传代、培养。

1.3 实验分组

分对照组、硝酸镓组，将细胞调整密度为1×105/ml接种在培养板上。

1.4 细胞增殖（MTT法）

用0.25%胰酶处理对数生长期的细胞成密度为1×105/ml的单细胞悬液，接种到96孔培养板上，各孔100μl。

硝酸镓组分别加入药物（终浓度为5、10、20、40、80μg/ml的硝酸镓），各孔终体积为150μl，对照组加入培养液（RPMI 1640），设3个复孔。分别培养24、48、72 h，终止培养前4 h再分别加入MTT（5 mg/ml）10μl，4 h后弃掉上清，加150μl二甲基亚砜液，震荡10min，酶标仪测值，计算细胞增殖抑制率，重复3次，取均值，绘制细胞增殖抑制曲线。

1.5 细胞凋亡（流式细胞仪法）

用0.25%胰酶处理对数生长期的细胞成密度为1×105/ml的单细胞悬液，接种到96孔培养板上，各孔100μl。

硝酸镓组分别加入药物（终浓度为5、10、20、40、80μg/ml的硝酸镓），各孔终体积为150μl，对照组加入培养液（RPMI 1640），设3个复孔，培养48 h。收集两组细胞，速度1000 r/min，离心5 min，弃掉培养液，用冷PBS两次洗涤细胞，筛网（400目）滤1次，滤后细胞调整浓度约为1×106/m l以1×Binding Buffer 400μl进行悬浮，再加入Annexin V-FITC 5 ul，轻轻混匀，在低温下，避光孵育15 min。再加PI 10μl混匀，低温下，避光孵育5 min后，在流式细胞仪上测定，计算细胞凋亡率。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 硝酸镓对HO-8910细胞增殖的抑制作用

以硝酸镓终浓度5、10、20、40、80μg/ml分别作用HO-8910细胞24、48、72 h。MTT结果表明，对HO-8910细胞明显抑制增殖。硝酸镓高浓组在24、48、72 h的抑制率分别为57.1%、59.4%、68.1%，不同时间点、不同浓度之间抑制率比较，差异有统计学意义（表1、图1）。

表1 硝酸镓对HO-8910细胞增殖的抑制作用（±s，n=3）

表1 硝酸镓对HO-8910细胞增殖的抑制作用（±s，n=3）

与正常对照组比较，*P＜0.01

组别（μg/ml）24 h OD 抑制率（%）48 h OD 抑制率（%）72 h OD 抑制率（%）正常对照组硝酸镓组5 10 20 40 80 1.052±0.012-1.043±0.110-0.953±0.031-0.752±0.012*0.671±0.204*0.602±0.201*0.542±0.132*0.454±0.141*28.2 36.3 42.6 48.5 57.1 0.705±0.018*0.648±0.102*0.583±0.247*0.522±0.521*0.421±0.328*32.3 37.5 44.0 50.1 59.4 0.624±0.008*0.544±0.113*0.461±0.005*0.381±0.078*0.302±0.164*34.4 43.1 51.7 60.2 68.1

图1 硝酸镓组抑制率曲线

2.2 硝酸镓诱导HO-8910细胞凋亡

流式细胞仪结果表明，硝酸镓随着药物浓度增加而凋亡增强（P＜0.01）（表2）。

表2 流式细胞仪检测高浓度组作用48 h后细胞凋亡结果（±s）

表2 流式细胞仪检测高浓度组作用48 h后细胞凋亡结果（±s）

与硝酸镓浓度5μg/ml组比较，*P＜0.01

硝酸镓浓度（μg/ml） 凋亡率（%）5 10 20 40 80 9.92±1.04 28.31±1.22*38.59±1.21*45.48±1.43*52.25±2.18*

3 讨论

镓作为金属元素，早期，在对肿瘤的定位及检测肿瘤细胞活性得到应用。近几年美国已作为non. Hodgkin的Ⅱ期淋巴癌治疗的临床用药［6］。镓用于肿瘤治疗，是继铂之后的第二个金属类药物，初步实验证明，它能通过转铁蛋白受体途径，抑制细胞内相关基因的表达［7-8］。另外，还发现镓能够抑制核苷酸还原酶的活性［9］，进一步地抑制细胞内DNA的合成，通过以上机制抑制肿瘤细胞的生长，从而有效地控制某些癌症［10-11］，与铂类药物相比，硝酸镓的一个重要特性是没有骨髓抑制和缺乏对其他药物的交叉耐药性［12-15］，这需要进一步研究，更好地了解其分子机制，并确定其临床疗效与其他药物的结合效应。

本实验结果表明，硝酸镓能很好地抑制细胞增殖，硝酸镓5μg/ml组抑制率随时间递增分别为28.2%、32.3%、34.4%；硝酸镓作用24 h组抑制率随药物浓度递增分别为28.2%、36.3%、42.6%、48.5%、57.1%，明显呈时间-剂量依赖效应。48 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，硝酸镓组凋亡率随药物浓度递增呈显著性差异（P＜0.01），与Kaluderovic等［5］在肿瘤治疗中，将镓化合物与顺铂进行比较的研究较一致，综合硝酸镓在HO-8910细胞增殖抑制与促进凋亡的结果，完全可以证明硝酸镓对卵巢癌HO-8910细胞作用效果显著。

以上研究表明，在体外细胞层面，对于卵巢癌HO-8910细胞，硝酸镓有显著的增殖抑制及诱导凋亡作用，应进一步进行动物模型实验，在动物整体水平研究镓对肿瘤细胞的作用效应及副作用，为肿瘤药物的研发奠定理论基础。

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Effect of gallium nitrate on Proliferation and aPoPtosis of ovarian cancer cells

YANG Hong-mei
Department of Obstetrics and Gynecology，Taihe District Hospital of Jinzhou City in Liaoning Province，Jinzhou 121001，China

Objective To study the effect of gallium nitrate on ovarian cancer cell line HO-8910，observe the effect on ovarian cancer cells HO-8910 induced apoptosis，inhibited the proliferation.Methods The human ovarian cancer cell line HO-8910 was cultured and treated with drugs （with different concentrations and time effect by gallium nitrate），apoptosis of cells was determined by flow cytometry.Proliferation of cells wasmeasured using MTT assay.Results The results of MTT and the results of flow cytometry showed that，the proliferation inhibition rate （80μg/ml）of 24 h was 57.1%，48 hwas59.4%，72 hwas68.1%；theapoptosis rateof5μg/mlwas（9.92±1.04）%，10μg/mlwas（28.31±1.22）%，20μg/ml was（38.59±1.21）%，40μg/mlwas（45.48±1.43）%，80μg/mlwas（52.25±2.18）%，gallium nitrate on the role of HO-8910 cellswere in a dose time dependent effect.Conclusion Gallium nitrate on ovarian cancer cells is significantly，provide a new way for tumor treatmentand preparation of anti-tumor drugs.

Gallium nitrate；Ovarian cancer cells；Cell proliferation and apoptosis

R737.31

A

1674-4721（2015）02（c）-0073-03

2014-11-04本文编辑：郭静娟）

杨红梅，女，本科，副主任医师；研究方向：妇产科肿瘤学