高效液相色谱法测定阴地蕨中山奈酚和槲皮素含量*

何可群

(贵州民族大学化学与环境科学学院，贵阳 550025)

阴地蕨(Botrychium ternatum)是阴地蕨科阴地蕨属多年生草本植物，又名肺心草、蕨叶一枝蒿、独蕨箕、一朵云等［1-4］。阴地蕨以全草入药，具有清热解毒、止咳平喘、平肝息风的功效，主治风热感冒、咽喉肿痛、百日嗽、肺结核、乳腺炎、腮腺炎、小儿惊风、疮痈肿毒、目生翳障、火眼肿痒等，是我国西南地区白族、彝族、纳西族、苗族等少数民族常用的野生草药［1-5］。目前对阴地蕨的研究报道还很少，已有的资料表明，阴地蕨的化学成分主要为黄酮、三萜、皂苷、香豆素、挥发油等，其黄酮类成分为阴地蕨素，槲皮素3-O-α-L-鼠李糖-7-O-β-D-葡萄糖苷及木犀草素等［4-6］。通过文献检索，笔者还未见有关阴地蕨中山奈酚的研究报道。本实验采用高效液相色谱-质谱串联(HPLC-MS/MS)获得分子量信息，进而通过与标样保留时间对比，确定阴地蕨的山奈酚及槲皮素成分，以峰面积对浓度的回归方程对两种成分进行定量测定。研究结果可以为该民族药的进一步开发及扩大资源利用提供科学依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1200 LC高效液相色谱仪(美国安捷伦仪器有限公司)及API3200 QTRAP MS/MS质谱仪(配ESI源、三重四级杆及线性离子阱，美国 AB SCIEX 公司)，Ecilipse XDB-C18(150 mm ×4.6 mm，5μm)色谱柱(上海笛柏实验设备有限公司);Agilent 1260 LC高效液相色谱仪，Eclipse plus C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，5μm)，G1314F 1260 VWD 可变波长紫外检测器，数显恒温水浴锅(常州博远实验分析仪器有限公司)，METTLERAE240电子分析天平(上海天平仪器厂，感量:0.01 mg)。

1.2 试剂 山奈酚(批号:520-18-3)及槲皮素 (批号:117-39-5)对照品均购自贵州迪大科技有限责任公司。磷酸为优级纯，甲酸、无水甲醇均为色谱纯，浓盐酸为分析纯，所有试剂用超纯水配制。阴地蕨样品购自云南省云龙县，经贵州民族大学卢文芸教授鉴定为阴地蕨(Botrychium ternatum)，标本保存于贵州民族大学化学与环境科学学院药学教研室。

2 方法与结果

2.1 色谱和质谱条件

2.1.1 HPLC-MS/MS 色谱柱为 Ecilipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5μm)，柱温:35 ℃，流动相:甲醇-0.1%甲酸溶液(85∶15)，流速为 1.2 mL·min－1。电喷雾离子源(electron spray ionization，ESI)，山奈酚采用MRM模式进行正离子监测，喷雾电压为5.5 kV、离子源温度600℃，去簇电压62 V，扫描范围m/z 50～305。槲皮素采用MRM模式进行负离子监测，喷雾电压为－4.5 kV、离子源温度 600 ℃，去簇电压－55 V，扫描范围m/z 50～305。

2.1.2 定量测定色谱条件 Agilent 1260 LC高效液相色谱仪，Eclipse plus C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(45∶55)，流速0.8 mL·min－1，检测波长360 nm，柱温30℃，进样量10μL。

2.2 对照品储备液的配制 精密称取槲皮素、山奈酚对照品各20.00 mg，分别置于50 mL量瓶中，加无水甲醇适量使其溶解，以无水甲醇定容。摇匀，配制成质量浓度均为400μg·mL－1的单一对照品储备液备用，临用前稀释为山奈酚0.800μg· mL－1及槲皮素1.00μg·mL－1浓度供质谱分析。

2.3 供试品溶液制备 将自然晾干的阴地蕨全草在电热鼓风干燥箱中于(60±1)℃烘干3 h，精确称取干燥、粉碎(过40目筛)的阴地蕨粉末0.250 g，用80%甲醇溶液20 mL浸泡、75℃水浴回流提取2次，每次1 h，提取结束后，合并提取液、冷却、滤过。滤液用80%甲醇水溶液补足至40 mL，加盐酸10 mL，85℃水浴回流酸水解1 h，迅速冷却，用无水甲醇定容至50 mL，摇匀，临用前过孔径 0.45μm 滤膜［7-9］。

2.4 HPLC-MS/MS实验 取对照品和供试品溶液3μL分别注入 HPLC-MS/MS，得到山奈酚对照品溶液、槲皮素对照品溶液、供试品溶液中的山奈酚及槲皮素的MS谱图(图1，2)。在正离子监测模式下，山奈酚对照品溶液和供试品溶液对应峰MS谱图产生5个主要的特征碎片离子 m/z287，185，161，153，121(图1)，m/s287为山奈酚的［M+H］+峰，证明样品中含有山奈酚［10-11］;在负离子监测模式下，槲皮素对照品溶液和供试品溶液对应峰MS谱图产生5个主要的特征碎片离子 m/s273，257，239，229，211(图 2)，m/z301.0为槲皮素的［M+H］+峰，证明样品中含有槲皮素［10-11］。由于采用负离子监测模式，槲皮素的MS图谱中没有出现m/z285峰。

2.5 保留时间的确定 将20.00μg·mL－1山奈酚、槲皮素混合对照品溶液按“2.1.2”项色谱条件进样分析，得到对照品及样品色谱图(图3)。结果阴地蕨供试品出现与混合对照品中山奈酚(18.66 min)、槲皮素(10.11 min)保留时间一致的两个峰。

2.6 线性关系考察 分别精密吸取质量浓度为400μg·mL－1的山奈酚、槲皮素标准溶液适量，配制成含山奈酚、槲皮素均为 2.50，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00μg·mL－1的混标溶液。以孔径 0.45μm 滤膜滤过，分别进样 10μL。在“2.1.2”项色谱条件测定峰面积，以对照品溶液浓度(X，μg·mL－1)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析，山奈酚:Y=29.85X－13.24，r=0.999 9;槲皮素:Y=43.86X－24.02，r=0.999 8。结果表明:山奈酚及槲皮素均在2.500～25.000μg·mL－1范围内呈现良好的线性关系。

图2 槲皮素对照品溶液(A)和阴地蕨供试品溶液(B)质谱图Fig.2 ESI-MS spectrum of quercetin standard solution(A)and Botrychium ternatum solution(B)

2.7 精密度实验 将质量浓度均为20.00μg·mL－1山奈酚、槲皮素混合对照品溶液按“2.1.2”项项色谱条件连续进样5次进行分析，以峰面积计算山奈酚及槲皮素的RSD分别为0.98%，0.79%，表明方法精密度良好。

2.8 重复性实验 取同一批样品(批号:20140116)5份，按“2.3”项方法制备溶液，按“2.1.2”项色谱条件进样分析，测定峰面积，计算山奈酚及槲皮素的平均质量分数，其RSD分别为1.53%和1.82%，表明方法重复性良好。

2.9 稳定性实验 分别在0，2，4，8 h将一供试品溶液按“2.1.2”项下色谱条件进行分析，测定色谱峰面积，计算山奈酚及槲皮素的RSD分别为2.36%，2.19%，表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率实验 ①精密称取5份已知含量的样品(批号:20140116)各0.250 g，分别精密加入山奈酚标准溶液适量;②精密称取5份已知含量的样品(批号:20140116)各0.125 g，分别精密加入槲皮素标准溶液适量。分别按“2.3”项下方法制备溶液，按“2.1.2”项下色谱条件进样分析，测定峰面积，计算各成分的量及加样回收率，结果山奈酚平均加样回收率98.34%，RSD=1.89%;槲皮素平均加样回收率98.68%，RSD=2.70%，见表 1。

1.槲皮素;2.山奈酚图3 混合对照品(A)和阴地蕨(B)的高效液相色谱图1.quercetin;2.kaempferolFig.3 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Botrychium ternatum(B)

表1 山奈酚和槲皮素加样回收测定结果Tab.1 Results of recovery tests on on kaempferol and quercetin n=5

2.11 样品测定 精密称取3批阴地蕨样品各3份，每份0.250 g，按“2.3”项下方法制备溶液，按“2.1.2”项色谱条件分别进行分析，测定峰面积，计算各成分的量，结果见表2。

表2 阴地蕨中山奈酚、槲皮素的测定结果Tab.2 Results of content determination on kaempferol and quercetin in Botrychium ternatum n=3

3 讨论

研究证实，阴地蕨有显著的抑制癌细胞增殖及转移的作用［12］，但迄今为止，其资源还未得到有效的开发利用，对其化学成分的研究报道也很稀少。笔者在本实验中用HPLC-MS/MS法对阴地蕨中山奈酚及槲皮素进行鉴定并测定二者的含量，首次报道阴地蕨中的山奈酚成分，实验结果进一步证实阴地蕨抗菌、抗炎、止咳等功效的物质基础，可以为该民族药的药用价值开发及扩大资源利用提供一定的科学依据。

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