磨球超微粉碎改性蚕蛹蛋白的工艺优化及功能特性
2015-11-12周志峰任子旭贾俊强桂仲争
周志峰,任子旭,贾俊强,2,桂仲争,2
(1.江苏科技大学生物技术学院,江苏镇江21200S;2.中国农业科学院蚕业研究所,江苏镇江21200S)
磨球超微粉碎改性蚕蛹蛋白的工艺优化及功能特性
周志峰1,任子旭1,贾俊强1,2,桂仲争1,2
(1.江苏科技大学生物技术学院,江苏镇江21200S;2.中国农业科学院蚕业研究所,江苏镇江21200S)
经磨球超微粉碎处理后的蚕蛹蛋白,其功能特性和结构会发生的一系列变化,在完成料液比、处理时间、PH对蚕蛹蛋白溶解度影响的单因素试验基础上,以蛋白质溶解度为评价指标,通过响应面分析法对磨球超微粉碎改性蚕蛹蛋白的工艺条件进行了优化,得到的最优工艺条件为料液比S.3 g·L-1、PHS.1、处理时间61 s.在此条件下,经处理后蚕蛹蛋白的溶解性、乳化性、乳化稳定性、起泡性和起泡稳定性分别提高了259.6%,50.0%,141.7%,61.0%和33.S%,而其持水性和吸油性却分别降低了25.3%和27.2%.
蚕蛹蛋白;超微粉碎;工艺优化;功能特性;溶解度
doi∶10.3969/j.issn.1671-7775.2015.06.011
蚕蛹作为蚕茧缫丝后的副产品,具有很高的营养价值,蛋白质含量达到干质量的45%~50%,其中S种人体必需氨基酸含量高达42.20%,1S种氨基酸的配比和必需氨基酸含量均符合WHO/FAO所规定的理想蛋白质模式[1].研究表明,蚕蛹蛋白粉的功效比值和生物价明显优于大豆蛋白,且易消化吸收,具有促进动物生长发育的作用[2].此外,蚕蛹蛋白可通过控制分解程度,制备出具有良好生理活性的多肽[3].因此,蚕蛹蛋白质的开发利用具有广阔的前景.然而,由于蚕蛹本身存在的一些不良特性以及蚕蛹蛋白特定加工生产技术的限制,在很大程度上制约了它的应用.因此,研究蚕蛹蛋白的加工生产技术,改善蚕蛹蛋白的基本功能特性是解决其限制因素的关键.
磨球超微粉碎是一种简便、常用的物理手段,利用它产生的巨大机械力、摩擦,改变蚕蛹蛋白的空间结构,从而改善其功能特性[4].乔一腾等[5]利用超微粉碎技术对大豆分离蛋白进行改性,结果发现经超微粉碎处理后,大豆分离蛋白的功能特性都明显提高.研究表明,不同来源蛋白质的氨基酸组成不尽相同,造成了蛋白质功能性的差异[6].溶解性是蛋白质的一个重要的功能特性,随着蛋白质溶解性的提高,蛋白质的乳化性和起泡性都得到了相应的提高[7-11].蛋白质的自身结构和溶液中的PH值、离子强度以及温度等都是蛋白质溶解性的重要影响因素[12].
本研究以蚕蛹蛋白为原料,以溶解度为考核指标,在单因素试验的基础上,利用响应面法对磨球超微粉碎处理蚕蛹蛋白的工艺条件进行优化,并对处理后的蚕蛹蛋白进行功能特性的研究.
1 材料和方法
1.1试验材料
蚕蛹来源∶中国农业科学院蚕业研究所.将蚕蛹于60℃下烘干粉碎至60目,脱脂,备用.
1.2试验方法
1.2.1蚕蛹蛋白的提取
将蚕蛹粉配置成10%的悬浮液,用1 mol·L-1的NaOH调节PH至10.0,55℃搅拌提取5 h,4 000 r·min-1离心10 min,收集上清液,用1 mol·L-1HCl调节PH至4.0,再离心,收集沉淀,冷冻干燥后备用[13-14].
1.2.2蚕蛹蛋白功能特性检测
溶解度的测定参考考马斯亮蓝的方法[15],以牛血清蛋白为标准对照.取蛋白质样品2 g,悬浮于100 mL蒸馏水中,调节PH为7.0,搅拌30 min后离心(S 000 r·min-1)20 min,取0.1 mL蛋白质溶液,0.9 mL蒸馏水,5 mL考马斯亮蓝G250试剂充分混合,放置2 min后,在595 nm波长下比色,记录吸光度.
乳化性的测定参考文献[16]方法,在测试管中分别加入15 mL质量分数1%蛋白质溶液和5 mL玉米油,乳液经高速分散均质机(24 000 r·min-1)处理1 min后,从测试管底部取出50μL乳液,用0.1%的SDS稀释100倍后,于500 nm比色.乳化活性指数(EAI,m2·g-1)和乳化稳定性指数(ESI,min)的计算公式如下∶
式中∶DF为稀释因子,DF=100;ρ为蚕蛹蛋白质量浓度,g·mL-1;φ为光程,φ=0.01 m;θ为油相所占体积分数,θ=0.25;A0,A10分别为0 min和10 min时的吸光度.
起泡性的测定参考文献[17]的方法,略有改变.配制质量分数l%的改性蚕蛹蛋白溶液,取200 mL在高速组织捣碎机中搅打2 min,迅速倒入500 mL量筒中,记录泡沫体积V1,静置10 min后再次测量泡沫体积V2,起泡性和起泡稳定性测定公式为
持水性的测定.取1 g蚕蛹蛋白,加入10 mL水,高速分散均质机12 000 r·min-1混合1 min,室温静置30 min,3 000 r·min-1离心10 min,测定蚕蛹蛋白的持水性[17],单位mL·g-1,公式为
吸油性的测定.取0.5 g蚕蛹蛋白,加入5 mL大豆油,高速分散均质机12 000 r·min-1,混合1 min,室温静置30 min,3 000 r·min-1离心10 min,然后测定蚕蛹蛋白的吸油性[1S],单位mL·g-1,公式为
1.2.3单因素试验和响应面法
由于本试验所选用的磨球超微粉碎机(青岛海纳微粉工程有限公司)内设固定震动频率25 Hz和振幅6 mm,所以本研究选择了料液比、处理时间、PH、温度等4个因素,这4个因素水平分别设计为料液比∶2.0,4.0,6.0,S.0和10.0 g·L-1;粉碎时间为30,40,50,60,70和S0 s;PH值为6.5,7.0,7.5,S.0和S.5;温度为20,25,30,35,40和45℃.
根据单因素试验的结果,由于处理温度影响较小,故选择料液比(a)、PH(b)、粉碎时间(c)为自变量,采用Box-Behnken中心组合设计原理[19],以蚕蛹蛋白溶解度为响应值,设计三因素三水平的中心组合.
2 结果与讨论
2.1单因素试验结果
2.1.1蚕蛹蛋白料液比对溶解度的影响
设定处理时间60 s,PH自然,温度25℃,研究了蚕蛹蛋白不同料液比对溶解度的影响,如图1所示.由图1可以看出随着蚕蛹蛋白料液比的增加,它的溶解度也随之增加,当蛋白料液比达到S.0 g·L-1时,溶解度最高,随后呈下降趋势.这可能是由于随着浓度的增加,更多的蛋白质分子受到超微粉碎机的影响,空间结构发生改变,使溶解度增加,当浓度增大到一定值时,粉碎机与蛋白质分子的接触面积不再增加,它的溶解度变化就会变得很小[4].
图1 料液比对蚕蛹蛋白溶解度的影响
2.1.2不同PH值对蚕蛹蛋白溶解度的影响
选择料液比6.0 g·L-1,时间60 s,温度25℃,研究不同PH值下蚕蛹蛋白的溶解度变化,如图2所示.从图2可以看出,随着PH值的增加,其溶解度逐渐增加,当蚕蛹蛋白溶液的初始PH为S.0时,它的溶解度达到最大值,随后呈下降趋势.这可能是由于PH过高或者过低时,蚕蛹蛋白的性质发生了改变,不利于其溶解度的增加.
图2 PH对蚕蛹蛋白溶解度的影响
2.1.3粉碎时间对蚕蛹蛋白溶解度的影响
当料液比为6.0 g·L-1,PH自然,温度25℃时,粉碎时间对蚕蛹蛋白的溶解度的影响如图3所示.由图3可以看出,随着粉碎时间的延长,蚕蛹蛋白的溶解度有一个先增加后降低的过程.当处理到60 s时,蚕蛹蛋白的溶解度最高,如果再延长处理时间,溶解度又逐渐下降.这可能是由于磨球超微粉碎逐渐使蚕蛹蛋白的肽链舒展甚至断裂,从而使它的溶解度增加,但是随着时间的延长,粉碎过程中产生了大量的热量,使蚕蛹蛋白发生变性,从而使溶解度减小[20].
图3 处理时间对蚕蛹蛋白溶解度的影响
2.1.4处理温度对蚕蛹蛋白溶解度的影响
当料液比6.0 g·L-1,PH自然,时间60 s时,处理温度对蚕蛹蛋白溶解度的影响如图4所示.随着处理温度从20℃上升到35℃,蚕蛹蛋白溶解度的变化不显著性;当处理温度进一步升高时,蚕蛹蛋白溶解度呈现下降的趋势.因此,本试验拟选择35℃作为磨球超微粉碎的处理温度.
图4 处理温度对蚕蛹蛋白溶解度的影响
2.2响应面试验结果
2.2.1响应面的曲线设计及结果分析
在单因素的基础上,选择料液比、PH、处理时间作为响应面因素,蚕蛹蛋白溶解度作为响应值,采用中心组合设计原理,进行二次回归旋转组合设计.试验各因素编码水平如表1所示,试验结果如表2所示.
我们定义一个正定的自相关矩阵C=E{xxH},其中x代表复随机矢量[7]。C的标准正交特征矢量和正定特征值分别由qi(i=1,2,...,n)和λi(i=1,2,...,n)表示。如果信号源的数目r比n小,那么R的特征值就可以表示成:
表1 响应面试验因素及水平设计
表2 Box-Behnken试验设计和结果
采用Design ExPert7.1.6统计软件对表2试验数据进行二次多项回归拟合,建立响应面的回归模型,得到蛋白质浓度(a)、PH(b)、处理时间(c)3个因素的二次多项回归方程∶
2.2.2方差分析
响应面回归模型的方差分析结果如表3所示.由表3表明,模型失拟项检验的P=0.220 5>0.05,差异不显著,且模型的P值<0.01,达到极显著水平,方程系数R2为0.9S1 6,模型调整确定系数为0.94S 6,说明该模型能解释94.S6%响应值的变化,变异系数为3.72%,试验有较好的精确度和可靠性,回归模型拟合度较好.回归模型的失拟项P值为0.421 0,失拟不显著,说明试验所得的二次回归方程可以较好地对响应值进行预测.
表3 响应面回归模型的方差分析
从表3中可以看出,对蚕蛹蛋白溶解度影响的显著性依次为料液比、PH、处理时间,其中a,a2,b2,c2对蚕蛹蛋白溶解度影响及其显著(P<0.01),b,c,bc对蚕蛹蛋白溶解度影响显著(P<0.05),ab,ac对蚕蛹蛋白溶解度影响均不显著(P>0.05).
2.2.3因素间的交互作用
各因素交互作用结果如图5所示.从图5a可以看到,在料液比不变的情况下,随着PH的变化,蚕蛹蛋白的溶解度先升高后下降,在PH7.S到S.2之间,溶解度较高;同样,当PH保持不变时,随着料液比的变化,蚕蛹蛋白的溶解度先升高后下降,在料液比7.0 g·L-1到9.0 g·L-1之间溶解度较高. PH、料液比和蛋白质溶解度在一定范围内呈现负相关,因此存在极值.从表3中可以知道,PH和料液比相互作用对蚕蛹蛋白溶解度影响的P=0.09S 2>0.05,因此两者存在一定的交互作用,但不明显.
由图5b可以看出,蚕蛹蛋白的溶解度随着处理时间和PH的变化,有一个先升高后降低的过程,当PH在7.S到S.3之间,粉碎时间在55 s到65 s时,蛋白质溶解度较高.蛋白质溶解度三维响应面呈现出清晰的峰,说明最优的条件在设计范围之中.此外从表3可以看到,PH和粉碎时间相互作用对蚕蛹蛋白溶解度影响的P=0.033 7<0.05,两者存在显著的交互作用.
由图5c可以看出,随着处理时间和料液比的变化,蚕蛹蛋白的溶解度先上升后下降,当粉碎时间在55 s到65 s时,料液比在7.0 g·L-1到9.0 g· L-1之间,蚕蛹蛋白的溶解度较高.蛋白质溶解度三维响应面呈现出清晰的峰,因此存在极值.由表3中可以看出,粉碎时间和料液比相互作用对蚕蛹蛋白溶解度影响的P=0.147 5>0.05,因此两者存在一定的交互作用,但不明显.
图5 工艺优化各因素水平的交互作用
2.2.4最佳工艺条件的确定和验证
由以上试验建立的回归方程可以看出,方程的二次项系数均为负值,响应曲面开口向下,因此存在极值点,可通过回归方程确定提取工艺的最佳条件.对二次回归方程进行积分求一阶偏导得出3个一元方程∶
对上述方程求解,得a=0.15,b=0.15,c=0.11.最终确定蚕蛹蛋白溶解度的最佳工艺条件为蚕蛹蛋白料液比S.3 g·L-1,PH S.1,时间61 s.在此工艺条件下,蚕蛹蛋白的溶解度可以达到11.S4 g·L-1.
对以上工艺条件进行3次平行验证试验,得到蚕蛹蛋白的溶解度为11.91,11.65,11.29 g·L-1,平均值为(11.62±0.31)g·L-1.验证结果与理论值基本一致,表明理论值与真实值有较好的拟合性.本试验建立的最优工艺条件可以采用.
2.2.5超微粉碎改性蚕蛹蛋白功能特性的测定
磨球超微粉碎对蚕蛹蛋白功能特性的影响见表4.从表可以看出,经过磨球超微粉碎处理后蚕蛹蛋白的溶解性、乳化性、乳化稳定性、起泡性和起泡稳定性均得到改善,分别比处理前提高了259.6%,50.0%,141.7%,61.0%和33.S%.这可能是磨球超微粉碎产生的巨大机械力改变了蚕蛹蛋白空间结构,从而使蚕蛹蛋白的亲水性基团处于外层,使蚕蛹蛋白溶解度大幅度增加,从而使乳化性和起泡性也相应的提高.此外,超微粉碎处理促进了疏水基团相互作用和—SH和—S—S—的交换反应,导致蛋白质分子间相互作用的增强,泡沫稳定性和乳化稳定性也有一定的提高[21-22].另外从表4也可以看出,经过超微粉碎处理后蚕蛹蛋白的持水性和吸油性分别降低了25.3%和27.2%.持水性的变化与蛋白质的溶解性息息相关,两者在一定程度上呈负相关,由于处理后更多的蚕蛹蛋白溶解入水中,因此造成了蛋白质持水性变小[23].蚕蛹蛋白吸油性减小主要归因于处理后蚕蛹蛋白亲水性基团外漏和蛋白表面亲脂基团的减少[24-25].
表4 蚕蛹蛋白经超微粉碎处理前后功能特性的比较
3 结 论
本试验利用磨球超微粉碎的方法改良蚕蛹蛋白的基本功能特性.采用Box-Behnken的中心组合旋转实验设计,通过响应面建立了超微粉碎改性蚕蛹蛋白的数学模型,从而得到了超微粉碎改性蚕蛹蛋白的最优条件为蚕蛹蛋白料液比S.3 g·L-1,PH S.1,时间61 s,对蚕蛹蛋白溶解度影响的显著程度依次为料液比、PH、处理时间.磨球超微粉碎的方法简便,对设备要求不高,并且改性后的蚕蛹蛋白功能特性有了较好的改善,这对于规模化开发蚕蛹蛋白的利用提供了技术支持.
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(责任编辑 祝贞学)
Process oPtim ization and functional ProPerties of silkworm PuPa Protein modified by grinding ball suPerfine comm inution
Zhou Zhifeng1,Ren Zixu1,Jia Junqiang1,2,Gui Zhongzheng1,2
(1.College of Biotechnology,Jiangsu University of Science and Technology,Zhenjiang,Jiangsu 21200S,China;2.Sericultural Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhenjiang,Jiangsu 21200S,China)
∶The molecular structure and functional ProPerties of silkworm PuPa Protein were imProved according to the Protein solubility after the treatment of suPerfine Powder.Based on the effects of ratio of material to liquid,treating time and PH value on the solubility of silkworm PuPa Protein,the Processing conditions of modified Protein in silkworm PuPa were oPtimized by resPonse surface analysis.The oPtimum conditions are obtained with Protein concentration of S.3 g·L-1,PH value of S.1 and Processing time of 61 s.Under the oPtimum conditions,solubility,emulsibility,emulsifying stability,foaming ability and foaming stability of the treated silkworm PuPa Protein are resPectively increased by 259.6%,50.0%,141.7%,61.0%and 33.S%,while the water-holding caPacity and oil-holding caPacity are decreased by 25.3%and 27.2%,resPectively.
∶silkworm PuPa Protein;suPerfine Powder;Process oPtimization;functional ProPerties;solubility
TS201.1
A
1671-7775(2015)06-0679-07
周志峰,任子旭,贾俊强,等.磨球超微粉碎改性蚕蛹蛋白的工艺优化及功能特性[J].江苏大学学报∶自然科学版,2015,36(6)∶679-6S5.
2015-02-01
公益性行业(农业)科研专项基金资助项目(201403064)
周志峰(1979—),男,江苏无锡人,博士研究生(zzf361S@hotmail.com),主要从事生物资源功能性利用的研究.
桂仲争(1962—),男,安徽潜山人,教授,博士生导师(通信作者,srizzgui@hotmail.com),主要从事生物资源功能性利用的研究.