无血清培养CHO细胞的研究进展

董慧君 曾宪卓 鲁 菲 郭明辉 张 哲

（深圳爱生再生医学科技有限公司，广东 深圳518057）

随着生物技术的飞速发展，单克隆抗体、细胞因子、疫苗和各种生物活性蛋白等生物制品在诊断和治疗中应用日益广泛，其需求量大大增加，因此，通过体外大规模培养动物细胞生产生物制品技术的研究越来越受到青睐。CHO细胞是生产蛋白类生物制品最重要的表达系统，采用无血清培养CHO细胞相比含血清培养，能避免对实验动物的伤害、潜在的污染源影响、不同批次血清间的生物活性和因子的不一致及价格高等诸多弊端，因而受到生物制药领域的广泛关注。

1 CHO细胞

CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell)，是最具代表性的动物细胞表达系统，被广泛应用于生物制药领域。它建株于1957年，由美国科罗拉多大学Theodore T.Puck从一成年雌性中国仓鼠卵巢中分离得到，是一种连续细胞系，能传百代以上，具有永生性。后来陆续又有很多科学家用药物加压、极端条件筛选和诱导突变等方法筛选得到了一系列不同表型的CHO细胞株[1]，如DUKX-B11、DG-44和CHO-K1等。

CHO细胞能用于表达各种复杂的重组蛋白。据统计，70%以上的动物细胞表达药物产品都是以CHO细胞为表达宿主[2]。2011年6月批准的27种单克隆抗体中，其中13种就是通过CHO细胞表达的，占了约50%的比例。

CHO细胞之所以成为最受欢迎的宿主细胞，主要在于其易于培养以及基因操作，而且相比其他表达系统，它还具有许多优点[3-4]：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；③具有外源重组基因的高效扩增和表达能力；④既可贴壁生长也可以进行悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，外源蛋白表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的后分离。

2 无血清培养基

无血清培养基是继天然培养基、合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比，无血清培养基不含动物血清或其他动物提取成分，但仍可满足细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基由基础培养基和添加组分两部分组成。基础培养基含有各种营养物质，能维持组织或细胞的生长、发育、遗传、繁殖等一系列生命活动。目前应用最广泛的是MEM、DMEM、RPMI1640等。添加组分为各种代替血清的因子总称，主要包括促贴壁物质、生长因子与激素、酶抑制剂、结合蛋白以及微量元素等几大类。这些因子既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素[5-6]。

3 无血清培养CHO细胞的研究进展

随着生物制品的需求加大以及无血清培养基诸多优势，越来越多的生物制药公司开始采用无血清培养基培养CHO细胞，研制适合于CHO细胞生长和产物表达的低成本无血清培养基是生物制药领域关注的热点。

3.1 无血清培养基成分研究

无血清培养基的成分相对比较清楚，人们可根据培养目的及细胞种类的不同，对培养基成分进行调整优化，以达到更好地培养目的。

研究证明，在无血清培养基中添加蛋白水解物可以提高最大细胞密度和生产效率。酵母水解物可作为一种低成本的无血清培养基添加物，用以成产人血小板生成素（hTPO）[7]。大豆水解物能较好地支持细胞生长和维持细胞活性[8]。Ballez等[9]研发出一种培养CHO-320细胞生产IFNγ的无蛋白培养基，该培养基中添加了大米水解物，最终最大细胞密度能提高25%，IFNγ浓度能提高60%。

还有研究评价激素、脂类及微量元素等成分对无血清培养CHO细胞的影响。赵丽丽等[10]以表达重组TNFR-Fc融合蛋白的CHOK1细胞为研究对象，确定大豆蛋白水解物和酵母提取物的混合物、地塞米松及脂肪乳剂这几种关键组分对培养基的影响，为适合于细胞生长和产物表达的低成本无血清培养基的研制提供了参考。张大鹤等[11]研制出两种适于重组CHO-K1细胞培养的无血清培养基。微量元素完全可以替换无血清培养基中的蛋白，支持细胞生长和促进蛋白表达。通过优化调整其他营养物质，去除蛋白水解物，且不需添加任何小肽化合物后，仍能支持高密度的CHO细胞培养。

添加氨基酸有利于维持细胞活性与抗体合成；添加B族维生素能促进细胞生长并延长培养时间；葡萄糖浓度较高时会抑制细胞生长，而浓度较低时又不能有效支持细胞的生长与抗体的合成，因此需要维持适当的浓度。通过合理调整这几类营养物的浓度配比形成的优化无蛋白培养基，可使培养的CHO细胞最高密度达到52.6×105cells/mL，抗体产量达到274mg/L，与初始培养基相比分别提高了33%和63%[12]。

通过对无血清培养基成分的适当调整和改进，可以实现对某一类细胞或细胞产物快速、专一的培养目的，如何将这些改进应用到大规模生产中还需要进一步的研究。

3.2 适用于悬浮培养的无血清培养基

悬浮培养是哺乳动物细胞大规模培养研究和应用的重要模式和首要选择[13-14]。CHO细胞为贴壁依赖性细胞，进行悬浮培养面临的最大问题就是细胞易集结成团使得细胞生长缓慢，且细胞团中央细胞因营养不足而容易凋亡。对于CHO细胞的悬浮培养而言，培养基是影响细胞生长和目标表达产物生产的最重要因素之一。目前已有适于CHO细胞大规模悬浮培养的商业化无血清培养基，但存在成分复杂、不明确及知识产权问题，影响培养基的进一步优化，且价格昂贵成本高，因此开发基于悬浮培养工艺的个性化无血清培养基至关重要。

研究发现腐胺、胰岛素及转铁蛋白对11G-S细胞的悬浮培养具有明显的生长促进作用，刘兴茂等[15]选择商业化的DMEM/F12(1∶1,V/V)为无血清培养的基础培养基，并选取了腐胺、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、β-巯基乙醇等常用添加剂，得到SFM-CHO-S无血清培养基，培养效果优于商品化的同类无血清培养基。郭纪元[16]从CHO细胞培养基库中筛选得到无血清基础培养基BM，在此基础上调整酵母水解物、硫酸葡聚糖、柠檬酸铁及起始葡萄糖与氨代谢相关氨基酸浓度，获得其个性化无血清培养基Opti-BM，并研发得到相应的流加悬浮培养基FM与FM plus。

孙亚婷[17]研制出PFIA无血清无蛋白培养基，比HyQ和Ex-302两种商业无血清培养基效果好，可作为后续流加培养的初始培养基。谢奎[18]获得自主知识产权的无血清培养基，经验证蛋白表达结果优于商业化培养基CD DG44，接近商业培养基P8，且成本节约一半以上。Zhang等[19]以表达重组TNFR-Fc融合蛋白的CHO-GS细胞为研究对象，以DMEM：F12：RPMI1640(2：1：1)为基础培养基，通过调整添加氨基酸、胰岛素、转运蛋白及Pluronic F68，并结合流加培养工艺，研制出适合CHO悬浮培养的无血清培养基。

4 结语

随着重组蛋白、单克隆抗体及病毒疫苗需求量的加大，动物细胞无血清培养基的研究越来越多，也取得很大进展。随着对细胞营养与代谢、细胞周期、细胞凋亡、信号转导以及外源蛋白表达机制等各方面机理的深入研究，以及蛋白质组学和代谢组学技术[20]在细胞培养基设计和研究上的应用，必将为进一步推进哺乳动物细胞无血清培养基的开发，从而使细胞培养技术在生物制备、基因工程、细胞移植等领域得到更安全、更低成本和更广泛的应用。

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