分子生物技术在污水处理系统内硝化菌群研究中的应用

杨浩　刁治民　梁洪兴

（1.青海师范大学生命与地理科学学院，青海 西宁 810008； 2.重庆市合川区瑞山中学，重庆 合川 401520）

分子生物技术在污水处理系统内硝化菌群研究中的应用

杨浩1刁治民1梁洪兴2

（1.青海师范大学生命与地理科学学院，青海 西宁 810008； 2.重庆市合川区瑞山中学，重庆 合川 401520）

分子生物技术近几年来得到了飞速发展，广泛应用于环境微生物的研究，本文详细介绍了最近几年研究人员在荧光原位杂交技术和聚合酶链式反应技术的基础上发展的几种新技术，并分析了这些技术的应用现状，对分子生物技术的发展做出了展望，希望能为污水处理系统稳定运行提供参考。

分子生物技术；硝化菌群；污水生物处理；荧光原位杂交

随着分子生物技术的发展，污水生物处理系统也随这发生了改进。污水生物脱氮是污水处理中最重要的环节，共包括两个阶段：硝化和反硝化。硝化阶段主要利用硝化菌进行处理，如氨氧化菌（AOB）、亚硝酸盐氧化菌（NOB）等。其中AOB可以将NH4+-N氧化成NO-2-N，NOB可以将NO-2-N氧化呈NO3-N。保证硝化细菌的存活和稳定繁殖是污水生物脱氮的关键所在。所以，利用分子生物技术对硝化细菌的活性、分布等进行研究，可有效促进污水脱氮系统的稳定与发展。目前，应用最多的分子生物技术是FISH技术（荧光标记的原位杂交）与PCR技术（聚合酶链式反应）。

1　基于FISH技术的分析方法

FISH技术是一种非放射性原位杂交技术。FISH的原理是检测目标微生物RNA的特殊序列，制作出相对应的核酸探针，并将其与目标微生物进行原位杂交，然后利用CLSM（共聚焦激光扫描显微镜）对微生物进行分析。如图1所示：

图1　

FISH技术可以检测污水中的丝状菌、聚磷菌、硝化菌等，随着研究的深入，人们对FISH技术进行了改进，研究出了如下几种技术：显微放射自显影FISH技术（FISH-MAR）、微电极FISH技术（FISH-microelectrodes）以及Clone-FISH技术。

1.1显微放射自显影FISH技术

使用单一的FISH技术无法采集微生物的生理信息，使用单一的显微放射自显影技术则不能识别细菌的分布。而当这两种技术被结合后，则能够通过照片的方式将细菌的结构、分布等清晰地展现出来，并且能够区分不同细菌的活性。

首先将需要分析的微生物进行培养，使其吸收底物中的放射性物质，通过放射自显影可以清晰地看到吸收了放射性物质的细胞（MAR+，呈黑色）。培养底物分为有机底物和无机底物，有机底物通常用14C进行标记，如14C-乙酸等；而无机底物一般使用NaH14CO3。研究人员在对显微放射自显影FISH技术研究时，先将硝化生物膜在无机物底物中培养6h，硝化菌中有呈MAR+的硝化自养菌与呈MAR-的异养菌，之后将这些细菌放入只含的底物中培养10h，大部分异养菌都呈MAR+。这个实验表明，异养菌可以通过14C来标记自养菌的代谢产物，使人们了解了在碳源不足时自养菌与异养菌的相互关系。研究结果表明，碳源不足时，自养菌与异养菌比例均为50%，这其中α-Proteobacteria占23%，γ-Proteobacteria占13%，Cytophaga Flavobacterium Bacteroides占2%，非硫细菌占9%，其他细菌占3%。

FISH-MAR虽然能够直观地对微生物结构、分布、代谢展开研究，但是对于细菌含量较低的物质却不适用此方法。因此，如果硝化菌中没有集中的菌落时，利用该方法将不能得到较好的检测结果。

1.2微电极FISH技术

微电极FISH技术可以检测污水生物生物膜内部的环境要素变化，进而检测出微生物的活性。利用微电极FISH技术可以清晰地了解微生物分布、代谢、环境三者之间的关系。微电极FISH技术主要测量O2、H2S、NO3、NH4+以及PH等。

研究人员利用微电极FISH技术对自养硝化菌生物膜和污水生物生物膜中氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的分布进行了研究。实验结果表明，亚硝酸菌（nitrosomonas）优势是氨氧化菌，而硝化螺旋菌（Nitrospira-like）优势是亚硝酸盐氧化菌，没有硝化细菌（nitrobacter）。利用微电极FISH技术能较好地分析生物扩增（人工投入培养的硝化菌，增加硝化菌数量及活性）和生物刺激（投入培育底物达到对硝化菌生长的促进或抑制）对污水生物生物膜硝化的影响。曾经有专家想要通过增加培养底物中NH4+和NO2-来促进氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的生长，但结果却适得其反，NO2-的氧化效果不仅没有增强，氨氧化菌的生长反而受到了抑制。

1.3Clone-FISH技术

用克隆的方法克隆出与检测物有同种基因片段的Clones（克隆子），与FISH技术结合就成了Clones-FISH法，此方法可应用在如下两个方面：①检测核酸探针的有效性。②利用FISH技术检验克隆子中是否具有与检测物相同的基因片段。

2　基于PCR技术的分析方法

在以往的检测方法中，人们通常是从污水中提取硝化菌，但这种硝化菌的DNA含量很低，为检测工作带来了很大麻烦。而PCR技术能够大量扩增DNA片段，从而解决了上述问题。

2.1amoA基因与16SrRNA基因

如果想要实现硝化菌DNA序列的扩增，首先应提取一段硝化菌带有进化标记的DNA序列，找出该序列的保守区，制作出与之匹配的探针。氨氧化菌的带有进化标记的基因一般是amoA基因与16SrRNA基因。

2.1.1amoA基因

amoA基因是编码氨单加氧酶的一种基因，编码氨单加氧酶是氨氧化菌独有的胞内酶，共有三个基因，分别是amoA、amoB、amoC，而amoA中含有编码氨单加氧酶的活性位点能够将铵催化成羟胺，为氨氧化菌的成长供应能量。一个氨氧化菌中含有2～3个amoA，不同的amoA功能也不一样。

2.1.216SrRNA基因

研究人员对16SrRNA基因的研究具有划时代的意义，增加了人们对微生物生长的认识。16SrRNA基因有很强的保守性，根据微生物中16SrRNA基因的不同可以将微生物分为两类，古细菌和细菌。许多书籍中对微生物的命名都是根据不同的16SrRNA基因分析的。一个氨氧化菌中只有一条16SrRNA基因，而不同的氨氧化菌的16SrRNA基因也不完全相同，从这些差异中可以看出不同氨氧化菌的关联与进化差异。

有关专家对不同氨氧化菌中的amoA基因和16SrRNA基因的排列顺序进行研究后发现，大部分氨氧化菌的amoA基因或16SrRNA基因的系统发育树都比较相似，正是由于这一相似性，导致用16SrRNA基因制作的探针检测的精确度受到影响。而amoA由于只在氨氧化菌中存在，尽管它对系统发育树影响不大，但由于它的差异性使得利用amoA基因制作的探针精确性与特异性比16SrRNA基因要强，能准确地辨别氨氧化菌的种属。目前，这两种探针都只能在自养型氨氧化菌中使用，而无法对实际污水中种群的多样性进行分析。

2.2PCR-变性梯度凝胶电泳克隆测序技术

PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术是将利用PCR技术扩增的DNA片段植入到凝胶中进行电泳的一种技术。凝胶一般是聚丙烯酰胺凝胶，且加入了梯度变性剂，一般是尿素和甲酰胺。利用PCR技术扩增的DNA片段长度是可控的，可以保证长度的一致性，但是DNA内部的碱基排列却有所不同。在进行电泳时，不同的碱基排列会根据梯度变性剂浓度的变化而发生变性，电泳速度越来越慢，最终各自停留在相应的位置，之后在对其进行染色，凝胶上就会出现若干条DNA谱带，一条谱带就是一个DNA片段。而这种方法经常会受到单链DNA、探针特异性等的影响，导致检测结果不准确。为了避免这一影响因素，研究专家经常会在测验后再进行Cloning（克隆）和Sequencing（测序），以对检测结果进行进一步确认，即所谓的PCR-DGGE-cloning-sequencing（PCR-变性梯度凝胶电泳克隆测序技术）。

研究人员利用此技术对污水处理系统内硝化菌群进行了研究，发现在污水处理过程中，氨氧化菌的数量是不会改变的。但是若受到外界因素（如温度、水质）的影响，氨氧化菌的种群结构会发生较大的改变。研究人员在研究曝气对污水中硝化细菌的结构与脱氮效率造成的影响时注意到，供氧时间的长短对污水中硝化菌的种群结构会产生一定的影响。经过研究，脱氮效率与氨氧化菌的含量以及种群多样性并无关系。

利用PCR-变性梯度凝胶电泳克隆测序技术能够清晰的展示污水处理中硝化菌的种群结构和数量的变化。然而，凝胶中DNA片段的碱基对一般不超过500，这一片段的序列又要与检测序列的重合度大于85%，否则就不能对硝化菌进行准确的分类，无法收集有关硝化菌的数据。另外，此技术的灵敏度不高，凝胶配置浓度不容易掌握，导致此技术对微生物含量少的种群没有理想的检测能力。

3　结论与展望

3.1分子生物技术从细微层面研究了影响污水处理系统中硝化菌生长的条件，文中所提到的脱氮技术应得到大力发展，例如：硝化、反硝化、短程脱氮、氨氧化等。脱氮技术能够对不同微生物种群的代谢加以识别，反映出微生物种群变化与污水处理系统设置参数的关系，从而更快速、更精准的做出一些改变，对污水处理系统能够稳定运行有深刻的影响及指导作用。

3.2在未来的发展中，应完善分子生物技术研究时的具体操作流程，积极引进新技术、新方法，提高检测的准确性以及特异性，如FISH-MAR、Clone-FISH、同位素探测等方法的操作流程应进一步完善，加强对核酸探针和引物的改进，使其能更精确地反映出微生物种群活性与外界环境的关系。相信在未来的污水处理中，分子生物技术会随着科技的进步，研究方法更方便快捷，在对污水处理系统的检测中更为稳定、精确，还可以为运行研发实时监测生物反应器提供技术引导。

［1］李磊，曾薇，张悦，杨莹莹.分子生物技术在污水处理系统内硝化菌群研究中的应用［J］.应用与环境生物学报，2010（1）：135-142.

［2］朱文优，张忠刚.分子生物学技术在环境微生物研究中的应用［J］.宜宾学院学报，2009（6）：88-90.

［3］王晓丹，李艳红.分子生物学方法在水体微生物生态研究中的应用［J］.微生物学通报，2012（4）：777-781.

［4］臧艺鹏，李悦，曲洋，等.固定化微生物技术——载体截留法在污水生物处理中的研究应用［J］.科技信息，2010（7）：355-356.

Application of Molecular Biological Technology in the Study of the Nitrification Bacteria in Wastewater Treatment System

Yang Hao1Diao Zhimin1Liang Hongxing2
（1.School of Life and Geographical Sciences，Qinghai Normal University，Xining Qinghai 810008；2.Chongqing Hechuan Quruishan Middle School，Hechuan Chongqing 401520）

Molecular biological technology has been rapid developedin recent years，widely used in the studyof en⁃vironmental microbiology，this paper introduces severalnew technologies developedin recent years by researchers based on fluorescence in situ hybridizationtechnology and polymerase chain reaction technology in detail，and ana⁃lyzes the running state ofthese technologies，makes a prospect for the development of molecular biological technol⁃ogy，hoping toprovide reference for the stable operation of sewage treatment system.

Molecular biologicaltechnology；Nitrification bacteria；Wastewater biological treatment；Fluorescencein situ hybridization

X703

A

1003-5168（2015）05-0125-3

2015-4-23

杨浩（1993.9-），男，本科在读，研究方向：生物科学。