米曲霉As-W6脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究

王开萍，李红卫，吴　娱，唐正江，汤　飞，刘国庆（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009）

米曲霉As-W6脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究

王开萍，李红卫，吴娱，唐正江，汤飞，刘国庆*
（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009）

米曲霉As-W6的脂肪酶发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52纤维素离子交换层析和Sephadex G-75葡聚糖凝胶过滤层析纯化后得到电泳纯的脂肪酶，纯化倍数为86.7倍，回收率为23.2%，相对分子质量为40.8 ku，酶学性质研究结果表明，该脂肪酶最适反应温度和最适pH分别为40℃和7，在40℃以下和pH6～8之间有较好的稳定性；Ca2+、Mg2+和丙酮能够明显促进提高脂肪酶的活性，而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS对其有显著抑制作用；当大豆油作为底物时该脂肪酶的酶活力最高，表明其对大豆油具有显著的特异性。

米曲霉，脂肪酶，分离纯化，酶学性质

脂肪酶（acylglycerol hydrolases，EC 3.1.1.3）是一类能催化水解脂肪酸和油脂为甘油和游离脂肪酸的生物催化剂，广泛存于动物、植物各种组织和微生物中［1］。脂肪酶因具有巨大的生理意义和工业应用范围而受到广泛关注，近年来，脂肪酶已广泛应用于食品、药品、化妆品、洗涤剂、制革、有机合成等行业［2］。生物来源的脂肪酶具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围，以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源［3］。最常用的脂肪酶生产菌有曲霉、根霉、毛霉、青霉菌属等［4-6］。米曲霉是脂肪酶生产者之一，且米曲霉脂肪酶具有良好的生物安全性，因而被广泛应用在脂肪酶生产行业或其他相关行业［7-8］。Aspergillus oryzae As-W6是本实验室筛选保存的一株产脂肪酶菌，产酶量高，培养要求简单，可进行大批量生产，国内外有关米曲霉产脂肪酶的研究相对较少，文献报道的米曲霉所产脂肪酶的温度、pH作用范围不大，稳定性不高［9-10］。本文对该米曲霉脂肪酶的分离纯化进行研究，提供了一种有关脂肪酶分离纯化的方法，该脂肪酶具有良好的温度稳定性和pH稳定范围，其具有良好的工业应用前景。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

Aspergillus oryzae As-W6本实验室选育保存菌种；DEAE纤维素、Sephadex G-75葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺Marker Sigma公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒上海碧云天生物技术有限公司；硫酸铵、甲醇、乙醇、丙醇、聚乙烯醇、橄榄油国药化学试剂有限公司，分析纯。

SW-CJ-1D型超净工作台苏州净化有限公司；SPX-150B型生化恒温培养箱上海博泰实验设备有限公司；752型紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；SYQ-DSX-280B型高压灭菌锅上海申安医疗器械厂；THZ-92B型摇床上海博泰实验设备有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅金坛市杰瑞尔电气有限公司；TDL-50B型台式离心机上海安亭科学仪器厂；SBE-6003型电泳仪上海博彩生物技术有限公司；GmbH紫外凝胶成像系统美国Biostep公司。

1.2脂肪酶的发酵生产与制备

脂肪酶的发酵生产参照陈林林等［11］的报道。菌种在PDA培养基上活化后，用无菌水制成孢子悬浮液，每毫升含105～106个孢子。按2%的接种量接到发酵培养基（酵母浸膏1%，葡萄糖1%，（NH4）2SO40.1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，KCl 0.05%，NaNO30.05%，橄榄油乳化液4%）中，在32℃，180 r/min发酵培养72 h。

1.3脂肪酶酶活的测定

脂肪酶酶活的测定采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解滴定法［12］。酶活力单位定义：在40℃，pH7.0条件下水解橄榄油乳化液，每分钟产生1 μmol游离脂肪酸所需要的酶量，即为1个脂肪酶活力单位（1U）。

1.4蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定采用Bradford法［13］测定，用牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白。

1.5脂肪酶的分离纯化

1.5.1硫酸铵沉淀参考舒正玉等［14］的方法加以改进，将发酵液用双层纱布过滤后，4℃，12000 r/min离心20 min得到发酵上清液，用0.45 mm的微孔滤膜过滤上清液除去橄榄油。收集滤液，将其作为酶液的粗提取，酶活被定义为100%，用来计算纯化过程中的回收率，回收率=每步总活力/原液总活力，比活力=总活力/总蛋白。先将粗酶液中加入硫酸铵细粉末至30%饱和度，去除杂蛋白沉淀，再向上清液中加入硫酸铵细粉末至80%饱和度，离心收集沉淀，透析脱盐后冷冻干燥保存备用。

就在族长即将暴怒时，一个声音从后方天葬院中传了出来：“我以天葬师之名，接受你的诉求，为了云浮的未来，敬祈天神！”

1.5.2离子交换层析将上述保存的酶溶解于0.05 mol/L，pH=7的Tris-HCl缓冲液中，然后上样于装有DEAE-52纤维素的层析柱中（1.8 cm×100 cm），以0～1.0 mol/L NaCl线性梯度洗脱，洗脱液流速为1.0 mL/min。在280 nm波长下，测定每管洗脱液的酶活力，收集合并有活性部分，真空冷冻干燥。

1.5.3凝胶过滤层析将上一步冷冻干燥的酶粉溶解于0.05 mol/L、pH=7的Tris-HCl缓冲液中，然后上样于装有Sephadex G-75葡聚糖凝胶的层析柱中（2.6 cm× 10 cm），以0～1.0 mol/L NaCl线性梯度洗脱，洗脱液流速为1.0 mL/min。按上述方法测定每管洗脱液的酶活性，收集合并有活性部分，真空冷冻干燥。

1.5.4脂肪酶分子量的测定采用聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定纯化酶的分子量，参照1970年Laemmli的方法［15］，根据胶浓度与最佳分离分子量范围的关系，选取分离胶的浓度为12%，浓缩胶的浓度为5%，用考马斯亮蓝G-250染色。蛋白质标准Marker的分子质量为19～117 ku。

1.6酶学性质研究

1.6.1不同温度对脂肪酶活性及其稳定性的影响将反应体系分别置于在20、30、40、50、60℃的水浴中，分别测定脂肪酶的酶活力，确定最适反应温度。取同样浓度的脂肪酶分别置于20、25、30、35、40、45、50、55、60℃的水浴中保温4 h，每隔1 h取样测定残留酶活，用未经处理的酶液的酶活为100%。

1.6.2不同pH对脂肪酶活性及其稳定性的影响将酶液分别与等量的pH4～10的系列缓冲液混合，测定脂肪酶的酶活。系列缓冲液为：50 mmol/L醋酸盐缓冲液（pH4～5），50 mmol/L柠檬酸缓冲液（pH5～6），50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6～8），50 mmol/L Tris缓冲液（pH8～9），50 mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9～10）。脂肪酶在pH4～10条件下分别在40℃保温1 h后，测定脂肪酶残留酶活，以最适条件下的酶活为100%。

1.6.3不同金属离子对脂肪酶活性的影响在测酶活反应体系中，分别加入终浓度为1 mmol/L和5 mmol/L的Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mn2金属盐离子，阴离子均为氯离子，30℃下放置30 min，分别测定脂肪酶的残留酶活，以不加金属离子的酶液作对照（100%）。

1.6.4不同有机溶剂对脂肪酶活性的影响将甲醇、乙醇、丙酮、EDTA、SDS、Tween-80 6种有机溶剂分别按1%、5%的量加入酶反应体系，然后反应30 min，分别测定脂肪酶的残留酶活，以未加入有机溶剂的酶液作为对照组（100%）。

1.6.5脂肪酶对不同底物的水解特异性参照Rigo等［16］的方法测定脂肪酶对不同底物的水解特异性，将橄榄油、大豆油、棕榈油、丁酸甲酯、辛酸甲酯、月桂酸甲酯、棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯作为脂肪酶水解反应的底物，分别测定脂肪酶的酶活，以橄榄油为底物测得的酶活为100%。

2　结果与分析

2.1脂肪酶的纯化

牛血清蛋白标准曲线如图1所示，y=5.93x-0.01，R2=0.9978，蛋白质浓度和吸光度呈良好的线性相关，根据标准曲线计算样品蛋白的含量。经硫酸铵分级沉淀、DEAE-52纤维素阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化后，脂肪酶蛋白纯化了86.7倍，回收率为23.2%，比活力为528.7。其中Sephadex G-75凝胶过滤层析效果最佳，这一步纯化了6.9倍，纯化结果见表1。采用聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定纯化酶的分子量，结果见图2，图中第1列为蛋白质标准Marker，第2列为粗酶液；第3列为纯酶。从图2中可以看出，第2列的粗酶液电泳所得的条带不止一条，除目标酶外还有三条颜色和清晰度均比较暗的条带，而纯化后的酶的条带如第3列所示，呈现明亮清晰的单一条带，目标蛋白位于34～49 ku之间，这说明目标脂肪酶得到了较好的纯化，回收率较高。通过Quantity One软件对凝胶图像分析计算，得出目标脂肪酶蛋白的分子量约为40.8 ku。

表1　米曲霉脂肪酶的纯化Table 1　Purification of lipase from Aspergillus oryzae As-W.6

图1　牛血清蛋白标准曲线Fig.1　The standard curve of BSA

图2　米曲霉脂肪酶的SDS-PAGE凝胶电泳分析图Fig.2　SDS-PAGE analysis of lipase

2.2米曲霉脂肪酶的最适温度及温度稳定性

在20～60℃下分别测定脂肪酶的酶活力，结果见图3，酶的最适反应温度为40℃，在温度不高于40℃时，酶活力随温度的升高而增加，当温度高于40℃时，酶活力会随着温度的升高而降低，当温度达到60℃时，酶活力仅为最适反应温度酶活力的8.6%。从图4中可以看出，该酶在35℃下保温4 h后还有83.2%的残余酶活，所以该酶在25～35℃具有较好的稳定性。

图3　温度对脂肪酶酶活力的影响Fig.3　Effect of temperature on enzyme activity

图4　脂肪酶的温度稳定性Fig.4　Heat stability of lipase

2.3脂肪酶的最适pH和pH稳定性

由图5可知，脂肪酶作用的最适pH为7，且在pH在6～7.5范围内，酶活力均在80%以上。将脂肪酶酶液加入上述不同pH的缓冲液中，在40℃下保温1 h后测定脂肪酶酶活，结果见图5。观察酶的pH稳定性曲线可知，在1 h的保温时间内，在pH＜7时，pH的稳定性会随着pH的增大而增强；在pH＞7时，pH的稳定性会随着pH的增大而减弱。在pH=4时保温1 h后，酶活力为保温前的酶活力的32.5%，但是在pH=10时保温1 h后，酶活力仅为保温前的酶活力的28.7%。由以上可知，该脂肪酶的最适反应pH为7，在pH 6～8时有较高的活力且在保温1 h后能保存70%以上的酶活。

图5　pH对脂肪酶的酶活力和稳定性的影响Fig.5　Effect of pH on enzyme activity and stability

2.4金属离子对脂肪酶活性的影响

如图6所示，在常见的几种二价金属离子中，浓度为1 mmol/L的Ca2+、Mg2+和Zn2+均能够激活酶的活性，金属离子浓度增加为5 mmol/L时，Ca2+、Mg2+对酶活性的激活性降低，而Zn2+则抑制酶的活性，Cu2+、Fe2+、Mn2+对酶活性的抑制作用增强，这可能是由于金属离子浓度升高对酶活性起抑制作用。不同金属离子对酶活力的影响不同，其中Cu2+、Fe2+对酶活力的抑制作用极强，Mn2+对酶活力也有抑制作用。此外，酶活力会随着几种金属离子浓度的增加均有所降低。因此，可以选择适当浓度的Ca2+、Mg2+作为该酶的活化剂，提高该脂肪酶的活力。

图6　不同金属离子对脂肪酶活性的影响Fig.6　Effect of various metal ions on enzyme activity

2.5有机溶剂对脂肪酶活性的影响

如图7所示，在常见的几种有机溶剂中，甲醇（1%）、丙醇（1%）和Tween-80（1%）能够进一步激活酶的活性，而乙醇、SDS和EDTA则抑制酶的活性。不同浓度的有机溶剂对酶活力的影响不同，但当浓度为5%时，这6种有机溶剂均对酶的活性起抑制作用。和金属离子相比，有机溶剂对酶活力的影响较小。由此可知，该脂肪酶是一种金属酶，金属离子对酶活的影响非常明显。

图7　不同有机溶剂对酶活的影响Fig.7　Effect of various organic solvents on enzyme activity

2.6脂肪酶对不同底物的水解特异性

从图8中可以看出，该脂肪酶对植物油的水解酶活力明显高于几种甲酯酸，其中大豆油表现最为明显的特异性。在5种甲酯酸中，该脂肪酶对C12、C16、C18显现出较高的酶活力，其中在C12时达到最高酶活力，这表明该脂肪酶对于长链甲酯酸表现出较好的水解酶活力，这与Rigo报道的从青霉菌（Penicillium crustosum）中纯化得到的脂肪酶的性质相似［16］。

图8　脂肪酶水解不同底物的特异性Fig.8　Substrate specificity of enzyme

3　结论

Aspergillus oryzae As-W6的脂肪酶发酵上清液经硫酸铵分级沉淀、透析、DEAE-52纤维素离子交换层析和Sephadex G-75葡聚糖凝胶过滤层析纯化后得到电泳纯的脂肪酶，SDS-PAGE电泳结果分析计算出其相对分子质量为40.8 ku，该脂肪酶的最适反应温度和最适反应pH分别为40℃和7，在40℃以下和pH6～8之间具有较好的稳定性。该脂肪酶的酶学性质研究结果表明，Ca2+、Mg2+和丙酮能够明显促进提高脂肪酶的活性，其中Ca2+的活化效果最好，可使酶活提高30%，而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS对其具有明显的抑制作用；此外该脂肪酶对大豆油表现出显著的特异性。

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Study on purification and characterization of a lipase from Aspergillus oryzae As-W6

WANG Kai-ping，LI Hong-wei，WU Yu，TANG Zheng-jiang，TANG Fei，LIU Guo-qing*
（College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

A lipase from Aspergillus oryzae As-W6 was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation，dialysis，DEAE-52 cellulose column anion exchange chromatography and Sephadex G-75 gel filtration chromatography.The purification protocol resulted in a 86.7-fold purification with a yield of 23.2%，the relative molecular weight of the purified lipase was 40.8 ku.The optimum temperature and pH of the purified lipase was 40℃and 7，respectively.The lipase was stable over ranges of pH（6～8）and under the temperature 40℃. The lipase activity was enhanced by Ca2+，Mg2+and Acetone，while inhibited by Cu2+，Fe2+，Mn2+and SDS.It achieved maximum values when soybean oil used as substrate，which indicated that the lipase showed a significant specificity toward soybean oil.

Aspergillus oryzae；lipase；purification；properties

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0229-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.037

2014－11－14

王开萍（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：paigewang0919@163.com。

刘国庆（1963-），男，博士，教授，研究方向：食品质量与安全，动物营养研究，E-mail：liugq_168@163.com。

安徽省皖江禽产业研究院基金项目（1401c063015）。