复方中药对急性冠脉综合征患者雌激素受体基因与基质金属蛋白酶-9基因甲基化水平的影响*

李楠宫丽鸿程修平

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳110032；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032）

·研究报告·

复方中药对急性冠脉综合征患者雌激素受体基因与基质金属蛋白酶-9基因甲基化水平的影响*

李楠1宫丽鸿2△程修平1

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳110032；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032）

目的探讨雌激素受体（ER）基因和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因甲基化水平与急性冠脉综合征（ACS）的关系，观察经中西医结合治疗后的ACS患者（痰浊血瘀证）ER基因和MMP-9基因甲基化水平。方法将ACS（痰浊血瘀证）患者180例设为ACS组，另选健康正常人40例设为正常组。将ACS组患者随机分为对照组90例和治疗组90例，对照组给予PCI及西医常规治疗，治疗组于PCI术后在西医常规治疗的基础上给予中药汤剂口服，疗程为1个月，采用甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）检测ACS患者治疗前后及健康人外周血细胞ER基因和MMP-9基因甲基化状态，比较正常组与ACS组、对照组治疗前后、治疗组治疗前后及治疗组与对照组治疗后ER基因和MMP-9基因甲基化水平。结果1）ACS组ER基因甲基化率明显高于正常组（P＜0.01），MMP-9基因甲基化率明显低于正常组（P＜0.05）；对照组与治疗组经治疗后其ER基因甲基化率均明显低于治疗前（P＜0.05），对照组与治疗组经治疗后其MMP-9基因基化率均明显高于治疗前（P＜0.05）；治疗后治疗组ER基因甲基化率低于对照组（P＜0.05）。结论ACS的发生可能与ER基因的高甲基化状态和MMP-9基因的低甲基化状态有关，复方中药对ACS（痰浊血瘀证）患者MMP-9基因与ER基因甲基化水平的双向调节可能是其发挥临床效用的机制之一。

复方中药痰浊血瘀急性冠脉综合征ERMMP-9甲基化

急性冠脉综合征（ACS）指急性心肌缺血引起的一组临床症候群，主要包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗死。急性心肌梗死结合心电图表现进一步分为ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死。目前认为该病的发病是由多种因素所决定的。随着分子生物学知识的飞跃进展，人们越来越认识到个体自身的遗传因素对冠心病的易感性起着决定性的作用［1］。DNA甲基化这一基因表遗传学修饰现象作为调节基因表达的重要机制逐渐被人们认识，修饰导致了动脉粥样硬化相关基因表达异常，在动脉粥样硬化发生发展中有重要作用。有研究报道在其发生过程中出现整体基因组的低甲基化和特殊基因的高甲基化共存现象［2］。

近年来，动脉粥样硬化的中医药实验研究主要集中于保护血管内皮、抑制血小板功能、抑制平滑肌细胞增殖、改善脂质代谢紊乱和脂质过氧化等方面。而中医药干预动脉粥样硬化基因组甲基化水平的研究尚属国内外研究空白。本实验目的有二：一是明确DNA甲基化异常与ACS发病的关系；二是探索搜风祛痰方对冠心病动脉粥样硬化相关基因甲基化水平的影响。现报告如下。

1　资料与方法

1.1病例选择诊断标准：不稳定性心绞痛、非ST段抬高型心肌梗死、ST段抬高型心肌梗死诊断按照2007年美国心脏学会及美国心脏病协会（ACC/AHA）制定的诊断标准。中医胸痹病名及证候诊断标准参照卫生部2002年制定发布的《中药新药临床研究指导原则》及《中医内科学》第6版教材相关证候诊断标准并做适当合并，辨证为痰浊血瘀证。纳入标准：符合西医急性冠脉综合征的诊断标准；愿意接受本研究者；符合急性冠脉综合征中医痰浊血瘀、痰风内动证诊断标准。排除标准：不符合诊断标准者；合并有较严重的肝肾等器质性病变者；各种实体瘤及血液系统肿瘤患者（因肿瘤患者亦可能存在基因组甲基化水平的异常）；纳入研究前使用过去甲基化药物者；风湿性心脏病、甲亢性心脏病、心肌炎、心肌病等非冠状动脉硬化性心脏病者；依从性差或因各种原因终止研究可能性大、不能完成研究流程者；病情危重，难以对本次实验的有效性作出确切评价者。

1.2临床资料收集曾就诊于本院心内科西医诊断为ACS、中医诊断为胸痹心痛（痰浊血瘀证）的患者180例，经冠脉造影证实，结果冠脉狭窄≥50%为阳性，体检中心正常人40例，做为本实验的研究对象。

1.3主要试剂及实验材料中药汤剂的制备：将搜风祛痰方（全蝎10 g，蜈蚣2条，地龙15 g，陈皮15 g，法半夏15 g，白术15 g，水蛭15 g，金银花10 g）按2000年版药典中药注射剂要求制成灭菌制剂，相当于生药含量5 g/mL，由辽宁中医药大学附属医院制剂室提供。基因组DNA提取：全血基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝生产，货号D1800，规格50 T/100 T）。基因组DNA甲基化修饰：甲基化DNA检测试剂盒（Cat. No.CW2140，北京康为世纪提供）。甲基化特异性PCR：PCR引物合成由上海生工合成。

1.4方法1）基因组DNA提取。所有受试者空腹8 h后（急性心肌梗死患者在行急诊冠脉介入治疗前）留取肘静脉血5 mL，按照全血基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝生产，货号为D1800，规格为50T/100T）说明书进行操作：取200 μL血液样本加入3倍体积的红细胞裂解液中，充分颠倒混匀，12000 rpm离心1 min，吸去上清，沉淀应为白色或淡红色，向沉淀中加入试剂充分混匀，反复离心、漂洗，得到高质量的基因组DNA样品。将180例ACS患者随机分为治疗组与对照组。对照组在行PCI明确诊断后，给予西医标准化治疗（血小板抑制剂、ACEI及他汀类药物等）；治疗组在行PCI明确诊断后，在西医标准化治疗的基础上，加用中药水煎剂搜风祛痰方，日1剂，分3次口服。治疗1个月后治疗组与对照组再次留取肘静脉血5 mL进行基因甲基化水平的检测。2）基因组DNA修饰。取每份样品约20 μL按照甲基化DNA检测试剂盒（Cat.No.CW 2140，北京康为世纪）进行修饰。经DNA亚硫酸氢盐转变，回收得到大量DNA溶液，通过结合-洗涤-洗脱步骤，从甲基化修饰后的溶液中回收纯化DNA，回收的纯化DNA置于-20℃保存DNA溶液，用于后续PCR实验。3）甲基化特异性PCR。首先从人类基因组数据库（genebank）中查找ER和MMP-9启动子及其上游全序列。根据文献和数据库分析其启动子活性位点，应用专用工具软件（Methyl Primer Express v1.0，Applied Biosystem公司）分析该序列的CpG岛位点后，分析亚硫酸氢钠修饰后的理论序列并设计如下引物，使其扩增区域包含其启动子活性区域和5个CpG位点（见表1）。

表1　甲基化特异性PCR反应的引物序列

1.5统计学处理使用SPSS17.0统计软件处理。率的比较运用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组ER基因甲基化水平比较ACS组外周血细胞中ER基因的甲基化率为65.5%，高于正常组的22.5%（P＜0.01）。治疗组与对照组治疗后ER基因的甲基化率分别为37.1%、51.7%，均低于治疗前的66.7%、63.3%（P＜0.05），治疗后组间差异有统计学意义（P＜0.05）。样本中含有甲基化ER基因序列时，M扩增出产物，U未扩增出；反之，样本上含有非甲基化ER基因序列时，U扩增出产物，M未扩增出，见图1。

图1　ER基因甲基化电泳图

2.2各组MMP-9基因甲基化水平比较与正常组比较，ACS组外周血细胞中MMP-9基因的甲基化率为26.1%，明显低于正常组的45.0%（P＜0.05）。治疗组与对照组治疗后MMP-9基因的甲基化率分别为42.2%、40.0%，均明显高于治疗前的26.7%、25.8%（P＜0.05），与对照组治疗后比较，治疗组治疗后MMP-9基因的甲基化率略有升高，差异无统计学意义（P＞0.05）。样本中含有甲基化MMP-9基因序列时，M扩增出产物，U未扩增出；反之，样本上含有非甲基化MMP-9基因序列时，U扩增出产物，M未扩增出（见图2）。

3　讨论

大量的研究证明ER介导的血管保护作用包括直接保护作用与间接保护作用。直接保护作用于心血管系统上的ER，可促进一氧化氮合酶的合成，促进内皮细胞的生长，抑制血管平滑肌的增生，抑制血管的损伤，抑制巨噬细胞向动脉粥样硬化病变处的聚集［3-8］。间接保护作用又分为作用于肝脏与肝外：作用于肝脏的RE调节载体蛋白A、B、D、E和脂蛋白（a）基因的表达，从而升高高密度脂蛋白，降低低密度脂蛋白，并且调节某些凝血因子和纤溶蛋白基因的表达，从而减低纤维蛋白原、抗凝血酶Ⅲ的浓度等；作用于肝脏外的ER调节肾素、血管紧张素转化酶基因的表达，从而降低血中肾素和血管紧张素转化酶的浓度［9］。根据大量的研究证据，人们认为MMP-9在动脉粥样硬化发生发展中具有多重作用：促进平滑肌细胞迁移到内膜下形成粥样斑块，导致粥样硬化斑块的进展；降解细胞外基质和胶原，导致斑块的不稳定和斑块破裂；通过调节细胞外基质的代谢和降解参与了脂质储留、钙质沉着、内皮细胞和平滑肌细胞的生物学行为改变等［10］。在基因水平的调节机制研究中，DNA甲基化是近年该研究领域的重大进展之一，其在动脉粥样硬化中的作用值得关注。DNA甲基化是指DNA复制后在CpG岛序列内的5′胞嘧啶被甲基修饰，导致DNA结合蛋白与DNA主螺旋沟的结合能力降低，从而在不改变基因结构的基础上抑制基因的转录，导致基因“沉默”［11］。其主要机制为：1）基因启动子区域高度甲基化，使得基因转录因子不能结合到该区域；2）高甲基化区域的组蛋白乙酰化酶活性升高，改变了染色体结构，使其不易转录；3）甲基化的CpG岛序列能募集结合有转录抑制作用的蛋白因子［2］。

图2　MMP-9基因甲基化电泳图

ACS属于中医学“胸痹”“真心痛”范畴。中医学认为该病为本虚标实之证，本虚为心阳气虚，标实为血瘀、痰浊。根据对ACS长期的临床观察及治疗经验，认为临床中ACS主要以痰浊血瘀证为主要证型，其发病多与风、痰、瘀、虚密切相关，胸痹总属阳微阴弦，因虚致痰，痰瘀交阻，郁而化热生风，风挟痰瘀痹阻胸脉，发为胸痹。搜风祛痰方由全蝎、蜈蚣、地龙、陈皮、法半夏、白术、水蛭、金银花组成，功善搜风祛痰，祛瘀通络，用于治疗ACS（痰浊血瘀证）。方中全蝎、蜈蚣息风止痉，活血化瘀，通络止痛；地龙既可清热息风，又能通络止痉，共为君药；陈皮、法半夏、白术燥湿化痰，理气宽胸，消痞散结，共为臣药；水蛭作为虫类化瘀药，破血力强而不伤新血，金银花疏风清热解毒，共为佐药。

现代药理研究表明，全蝎含蝎毒，一种类似蛇毒神经毒的蛋白质，蝎毒对血小板聚集功能的影响有助于减少斑块形成，延缓动脉粥样硬化进程［12］，另外全蝎提取液可通过促进纤溶、抑制血小板聚集而抑制血栓形成［13］；蜈蚣具有增强心肌抗氧化能力、降低血脂、改善血液流变学指标、调节脂代谢及保护心肌免受脂质过氧化损伤的作用，可保护血管内皮细胞免受损伤，有效防治动脉粥样硬化的形成；地龙具有降血脂、抗菌、抗氧化、降压、抗心律失常、抗凝血、溶血栓的作用，还具有解热、抗炎、镇痛、镇静、抗惊厥、止咳平喘、抗肿瘤、免疫调节、促进伤口愈合的作用［14］；水蛭具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗肿瘤、抗癌和抗纤维化作用［15］；陈皮中黄酮类化合物具有抗动脉粥样硬化、降低血清胆固醇、抑制血小板聚集、抗癌和抗氧化作用［16］；法半夏可阻止或延缓食饵性高脂血症的形成，对高脂血症有一定的治疗作用，其中对降低总胆固醇和低密度脂蛋白的作用较显著［17］；白术具有抑制脂肪形成、抑瘤，抗炎作用和芳香化酶抑制作用［18］；金银花具有强大的降血脂作用，尤其针对血清胆固醇水平，并有弱的降糖作用。

实验中ACS组ER基因甲基化率较正常组有明显升高，治疗后治疗组与对照组ER基因的甲基化率较治疗前均明显降低，其中治疗组ER基因甲基化率明显低于对照组；ACS组MMP-9基因甲基化的率较正常组明显降低，治疗后治疗组与对照组MMP-9基因的甲基化率较治疗前均明显升高，其中治疗组与对照组的MMP-9基因甲基化率虽不具有统计学差异，但治疗组甲基化率稍高于对照组。实验结果表明ACS的发病可能与ER基因的高甲基化状态和MMP-9基因的低甲基化状态有关。搜风祛痰方可降低ACS患者的ER基因的甲基化率并且升高MMP-9基因的甲基化率，即对基因甲基化具有双向调节作用，为中西医结合治疗ACS提供了新的作用靶点与科学依据。

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The Effect of Compound Chinese Medicine on Gene Methylation Level of ER Gene and MMP-9 Gene with ACS

LI Nan，GONG Lihong，CHENG Xiuping.
Liaoning University of TCM，Liaoning，Shenyang 110032，China

Objective：To study the relationship between the gene methylation level of estrogen receptor（ER），matrix metalloproteinase-9（MMP-9）and ACS，and observe the improvement of symptoms and the gene methylation level of ER and MMP-9 of combined treatment of traditional chinese and western medicine in treating ACS（phlegm and blood stasis type）.Methods：180 ACS patients diagnosed as phlegm and blood stasis type were selected as ACS group，40 normal people as the normal group.The 180 cases of ACS group were randomly divided into the control group（90 patients）and the treatment group（90 patients）.The control group took PCI and the routine western medicine（Platelet inhibitors，ACEI and Statins，ect.）.The treatment group were treated with Traditional Chinese Medicine.Treatment lasted for 1 months.MMP-9 and ER DNA methylation were detected before and after treatment in ACS patients and the normal group with methylation-specific PCR.The demethylation levels were compared among the normal group and ACS group，the control group before and after treatment，the treatment group before and after treatment，the treatment group and the control group after treatment.Results：Comparing with ACS group and the control group，there was the higher level of methylation rate of ER and the lower level of methylation rate of MMP-9 gene in the ACS patients，with statistical significance（P＜0.01）.The level of methylation rate of ER gene in both the control group and the treatment group after treatment were significantly lower than pre-treatment，with statistical significance（P＜0.05）.The levels of methylation rate of MMP-9 gene in both the control group and the treatment group after treatment were significantly higher than pre-treat-ment，with statistical significance（P＜0.05）.The methylation rate of ER gene of the treatment group after treatment was lower than that of the control group after treatment，with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：The incidence of ACS may be associated with its high methylation status of ER gene and low methylation status of MMP-9 gene.Its regulating effect of the combination of traditional Chinese and Western medicine on the gene methylation level of ACS patients（Phlegm and blood stasis type）may be one of the mechanism of clinical effect.

Compound Chinese medicine；Phlegm and Blood stasis；Acute coronary syndrome；ER；MMP-9；Methylation

R541.4

A

1004-745X（2015）10-1746-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.018

2015-06-19）

辽宁省沈阳市科技创新专项资金（F13-220-9-06）

（电子邮箱：linda1795@sina.com）