淫羊藿、女贞子协同地塞米松影响哮喘大鼠糖皮质激素受体的研究*

唐秀凤刘仁慧年宏蕾肖般若惠娅杨燕罗良涛许利平王秀娟

（首都医科大学中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京100069）

·研究报告·

淫羊藿、女贞子协同地塞米松影响哮喘大鼠糖皮质激素受体的研究*

唐秀凤刘仁慧△年宏蕾肖般若惠娅杨燕罗良涛许利平王秀娟

（首都医科大学中医药学院，中医络病研究北京市重点实验室，北京100069）

目的观察中药淫羊藿、女贞子对地塞米松干预大鼠哮喘模型全身及局部不同水平糖皮质激素受体（GR）的影响。方法建立大鼠哮喘模型，腹腔注射地塞米松2周治疗，同时配合灌胃淫羊藿女贞子煎液，流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液（BALF）与血淋巴细胞中GR蛋白及GR结合力的表达。结果哮喘模型组血淋巴细胞及BALF中GR结合力均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；与哮喘模型组比较，激素干预组BALF中GR蛋白表达量明显降低（P＜0.01），血淋巴细胞及BALF中GR结合力均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；应用激素的同时合用淫羊藿女贞子，能显著上调BALF中GR蛋白量（P＜0.05）及血淋巴细胞及BALF中GR结合力（P＜0.05或P＜0.01）。结论在激素应用的同时合用中药淫羊藿、女贞子在整体及局部水平均能提高因糖皮质激素（GC）干预下降的GC结合力，改善GR对GC的耐受，提高支气管肺组织及机体对激素的敏感性。

哮喘淫羊藿女贞子地塞米松糖皮质激素受体（GR）

随着对哮喘发病机制的深入研究，气道炎症学说得以确立，因为糖皮质激素（GC）具有良好的抗炎作用，所以临床应用GC作为防治哮喘的首选药，而临床实践中使用GC是一把双刃剑。在治疗疾病的同时会出现，如激素依赖、激素抵抗以及局部和全身性副作用［1］。中医学在治疗哮喘及对于激素造成的不良反应也有很好的疗效。前期研究结果提示，在哮喘模型激素治疗的不同时段给予适量中药淫羊藿、女贞子，可呈现“减毒增效”的药效［2-3］。GC生物学作用的发挥主要取决于和GR的结合及之后启动的转录进程［4］。为进一步研究中药所发挥作用的机制，笔者对比研究整体（血淋巴细胞）及局部（支气管肺泡灌洗液，BALF）不同水平中GR蛋白及GR结合力的改变，探索中药淫羊藿、女贞子合用GC治疗哮喘的协同作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物雄性SPF级SD大鼠30只，体质量（120± 10）g，合格证号：SCXK（京）2012-0001。由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。饲养于SPF级动物实验中心，实验期间动物自由饮水、摄食。

1.2试剂与仪器402A超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备有限公司），流式细胞仪FACS Calibur（美国BD公司），雾化箱（以有机玻璃为材料自制，规格：40 cm×30 cm× 20 cm）。卵清白蛋白（OVA，美国Sigma公司，A5253-250 g）、氢氧化铝（北京化工厂，批号20120028）；淫羊藿水提物（批号20130115）、女贞子水提物（批号20130104）（西安康威生物有限公司）；地塞米松磷酸钠注射液（5 mg/支，国药集团容生制药有限公司，批号H41020036）；大鼠外围血淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号LTS1083-200）；GR单克隆一抗（Abcam，批号ab9568）；Fitc-GR二抗（Abcam，批号ab51379）；PE-地塞米松（Molecular Probes，批号D1383）。

1.3分组与造模按照随机数字表法将实验动物分为5组，正常对照组（N组）、哮喘模型组（A组）、激素干预组（GC组），淫羊藿女贞子组（YN组），淫羊藿女贞子合激素干预组（YN+GC组），每组6只。于实验1～35 d，除N组外，其余动物全部造模。实验22 d开始给药共计2周，GC组及YN+GC组腹腔注射地塞米松注射液（0.5 g/kg）；YN组及YN+GC组给予淫羊藿女贞子水提物（4：3配比，3.5 g/kg）；N组及A组给予等体积的0.9%氯化钠溶液［5］。

1.4观察指标实验36 d处死动物，腹主动脉取血抗凝，参考试剂盒说明书分离淋巴细胞；开胸，取肺组织连同气管，行支气管肺泡灌洗术［6］，回收支气管肺泡灌洗液（BALF）离心，收集BALF细胞沉渣。采用流式细胞术检测血淋巴细胞及BALF细胞GR蛋白表达及GR结合力［7］。

1.5统计学处理应用SPSS16.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差齐性检验、单因素方差分析及相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠血淋巴细胞及BALF中GR蛋白表达量的比较见表1。与N组比较，A组血淋巴细胞及BALF中GR蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与A组比较，GC组BALF GR蛋白含量明显降低（P＜0.01），而血淋巴细胞GR蛋白含量无显著改变（P＞0.05）；与GC组比较，YN+GC组BALF GR蛋白含量显著升高（P＜0.05）。

表1　各组大鼠血淋巴细胞及BALF中GR蛋白表达量比较（平均荧光强度，±s）

表1　各组大鼠血淋巴细胞及BALF中GR蛋白表达量比较（平均荧光强度，±s）

与N组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与A组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与GC组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

组别n血淋巴细胞GR蛋白BALF GR蛋白N组67435.33±1616.992505.17±355.87 A组66887.33±1621.602069.50±482.77 GC组67808.33±2164.57**1517.00±410.02**△△YN组66728.50±2055.912383.17±423.27▲▲YN+GC组68586.17±2086.272143.83±323.72▲

2.2各组大鼠血淋巴细胞及BALF中GR结合力的比较见表2。与N组比较，A组血淋巴细胞及BALF中GR结合力均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；与A组比较，GC组血淋巴细胞及BALF中GR结合力均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；与GC组比较，YN+GC组血淋巴细胞及BALF中GR结合力均显著上升（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各组大鼠血淋巴细胞及BALF中GR结合力比较（平均荧光强度，±s）

表2　各组大鼠血淋巴细胞及BALF中GR结合力比较（平均荧光强度，±s）

组别n血淋巴细胞GR结合力BALF GR结合力N组63214.33±468.4527777.83±5505.21 A组62653.33±480.80*18888.17±4535.93**GC组62221.33±401.28**△8567.33±2204.33**△△YN组62792.33±287.29▲21862.67±3442.39▲▲YN+GC组62712.33±451.52▲16715.83±3411.94▲▲

2.3GR蛋白表达与GR结合力的相关分析见表3。血淋巴细胞GR蛋白表达量均与血淋巴细胞、BALF两个水平中GR结合力无相关；而BALF中GR蛋白表达量均与两个水平的GR结合力均呈显著正相关（r= 0.468、0.540，均P＜0.01）；此外，GR结合力在血淋巴细胞与BALF两个水平有显著性正相关（r=0.587，P＜0.01）。

表3　GR蛋白表达与GR结合力的相关性分析（r值，n=30）

3　讨论

课题组前期研究发现，在地塞米松治疗哮喘模型动物的不同时段合用淫羊藿和女贞子，可以协同GC增强抗炎并减轻GC所引起的不良反应［4-5］，提示对内源性GC作用途径受损有良好的保护作用，可能通过恢复激素的敏感性从而发挥激素的强大抗炎作用。GC发挥其生理和药理作用依赖于和GR结合，通过反式抑制或反式激活作用分别抑制或激活细胞核内基因转录。有研究认为，GR缺陷在哮喘发病机制中具有重要意义，无论何种程度的支气管哮喘，其外周血白细胞GR水平均明显降低，且哮喘越严重，这种受体水平的下降越显著［8］。本研究采用流式细胞术检测血淋巴细胞（整体水平）与BALF（局部）中GR蛋白表达及GR结合力，评价外源性激素全身用药对哮喘大鼠整体及局部不同水平中的GR功能的影响及中药协同激素的作用。结果显示，哮喘模型大鼠的GR结合力在整体及局部水平均显著降低，提示哮喘大鼠存在GR功能下降，从而导致激素用药的敏感性降低。与A组比较，GC组血淋巴细胞及BALF中GR结合力进一步下调，且出现BALF GR蛋白量明显降低，提示激素的全身应用，不仅在整体及局部出现GR功能的显著抑制，且对局部GR蛋白表达亦有下调；结合相关分析结果显示，哮喘大鼠在整体及局部两个水平的GR结合力同步下降，而两个水平的GR结合力又均与BALF蛋白表达量呈正相关，进一步验证了激素全身用药治疗哮喘时，对GR蛋白功能的抑制作用更明显，对GR蛋白表达量的抑制主要出现在局部，可导致机体对激素的敏感性逐渐下降。而应用激素的同时合用淫羊藿、女贞子，能显著上调BALF GR蛋白表达及血淋巴细胞、BALF中GR结合力，在整体及局部水平均能提高因GC干预下降的GR与GC的结合能力，改善GR对GC的耐受，提高支气管和肺组织对GC作用的敏感性，以更好地发挥内源性GC对机体的保护作用，这可能是平补阴阳中药淫羊藿、女贞子协同GC治疗哮喘发挥协同作用并缓解GC不良反应的可能作用机制之一。

［1］戎霞君，李以琳，蔡映云.吸入激素防治哮喘存在的问题和对策［J］.国外医学：内科学分册，2002，29（2）：64-66.

［2］刘仁慧，王秀娟，袁颖，等.淫羊藿、女贞子对激素干预哮喘大鼠骨代谢的影响［J］.吉林中医药杂志，2012，32（5）：490-492.

［3］刘仁慧，许利平，王秀娟，等.淫羊藿女贞子合用地塞米松抗哮喘大鼠的研究［J］.中国中药杂志，2012，37（10）：1497-1499.

［4］王力宁，罗梅芳，黄小琪，等.六味地黄丸（颗粒）对哮喘小鼠糖皮质激素受体mRNA作用的研究［J］.中华中医药杂志，2010，25（9）：393-1397.

［5］刘仁慧，郑君芳，袁颖，等.淫羊藿女贞子配伍调节哮喘大鼠NO/ET及HPA轴作用的研究［J］.中国中药杂志，2010，35（12）：1590-1593.

［6］刘仁慧，王秀娟，许利平，等.培本方对哮喘模型大鼠的药效学研究［J］.中成药，2009，2010，32（5）：741-744

［7］刘仁慧，王秀娟，张伟华，等.淫羊藿女贞子对激素干预哮喘大鼠模型HPA轴及GR的影响研究［J］.中华中医药杂志，2013，28（11）：3215-3219.

［8］王力宁，罗梅芳，黄小琪，等.六味地黄丸（颗粒）对哮喘小鼠糖皮质激素受体mRNA作用的研究［J］.中华中医药杂志，2010，25（9）：1393-1396.

Effects of the Combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi on GR in the Asthmatic Rats with Dexamethasone Intervention

TANG Xiufeng，LIU Renhui，NIAN Honglei，et al.
School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University and Beijing Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Collateral Disease Theory Research，Beijing 100069，China

Objective：To investigate the effects of the combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi on GR in the asthmatic rats with dexamethasone intervention.Methods：Asthmatic model was duplicated by OVA（ovalbumin）through sensitizing and challenging in rats.With the injection of dexamethasone and（or）the oral administration of the combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi，the protein expression and binding force of GR in blood lymphocyte and BALF were observed by flow cytometry.Results：Compared with the normal group，the binding forces of GR in the blood lymphocytes and BALF in model group were significantly decreased（P＜0.01 or P＜0.05）.Compared with the model group，GR protein content of BALF and the binding force of GR of the blood lymphocytes and BALF in the GC group were significantly lower（P＜0.05 or P＜0.01）. Application of the hormone accompanied by the combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi could significantly increased GR protein content in BALF and the binding force of GR in the blood lymphocytes and BALF（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：The combination of Herba Epimedii and Fructus Ligustri Lucidi can improve the sensitivity of the lung tissue and the body to the hormone.

Asthma；Herba Epimedii/Fructus Ligustri Lucidi；Dexamethasone；GR

R285.5

A

1004-745X（2015）10-1699-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.003

2015-06-16）

国家自然科学基金资助项目（No.81373814）；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目（No. CIT&TCD201504097）；北京中医药薪火传承“3+3”工程二室一站建设项目（No.2012-SZ-C-42）

（电子邮箱：gzblrh@ccmu.edu.cn）