副猪嗜血杆菌反应调节因子CpxR自杀性质粒的构建

付书林　陈夏冰　何斌等

摘要：以副猪嗜血杆菌双组分信号转导系统CpxA/R中反应调节因子CpxR为研究对象，成功构建自杀性质粒ΔpEM-CpxR，这就为构建副猪嗜血杆菌CpxR突变株以及探究CpxA/CpxR双组分信号转导系统调控副猪嗜血杆菌分子致病机制提供了基础。

关键词：副猪嗜血杆菌；反应调节因子；CpxR；自杀性质粒

中图分类号：S852.61+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4787-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.033

Abstract：Haemophilus parasuis （H. parasuis）， the causative agent of swine polyserositis， polyarthritis， and meningitis， is one of the most important bacterial diseases of pigs worldwide. The response regulator CpxR of two-Component Transduction System CpxA/R of H. parasuis was studied and the suicide plasmid ΔpEM-CpxR was successfully constructed， which providing the basis of constructing CpxR gene deletion mutant and exploring the TCS of CpxA/CpxR regulating the molecular pathogenesis of H. parasuis.

Key words： Haemophilus parasuis； response regulator； CpxR； suicide plasmid

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis， HPS）引起猪的革拉氏疾病，临床特征以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为主要特征。随着规模化养猪技术的应用和饲养高度密集化，由副猪嗜血杆菌引起的副猪嗜血杆菌病已经成为当前猪场最重要的细菌性传染病之一，给世界养猪业带来巨大的经济损失[1]。双组分信号转导系统（Two-component transduction system， TCS）是细菌中广泛存在的信号转导机制，在病原菌中起着“神经系统”作用。经典的双组分模式是由膜上的组氨酸激酶（Histine kinase， HK）和胞质上的反应调节因子（Response regulator， RR）组成[2]。应用序列相似性比较及功能域分析，表明在HPS-SH0165全基因组序列中存在CpxA/CpxR双组分信号转导系统。本试验成功构建HPS反应调节因子CpxR自杀性质粒，为构建CpxR基因缺失突变株提供前期基础，同时也为探究CpxA/CpxR双组分信号转导系统调控副猪嗜血杆菌分子致病机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 各种限制性内切酶、Ex Taq/LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、RNase酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）、氯霉素（Chloramphenicol， Cm）均购自美国英骏公司。DNA回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白大豆肉汤（Tryptic SoyBroth，TSB）粉剂购自美国Becton Dickinson and Company公司。

1.1.2 菌株与质粒 副猪嗜血杆菌血清5型SH0165菌株和自杀性质粒pEMOC2由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室馈赠。

1.2 方法

1.2.1 SH0165菌株中CpxR基因上下游同源臂的扩增与鉴定 参照已测序HPS血清5型SH0165菌株基因组序列，设计Cpx1、Cpx2、Cpx3、Cpx4两对引物，扩增CpxR基因的上下游同源臂。以SH0165菌株为模板进行扩增，对PCR产物进行检测、回收，连接到pMD-18T载体上，并转化DH5α菌株，提取质粒并进行酶切鉴定。

1.2.2 重组转移质粒pEM-CpxR的构建 将测序正确的T-P1用限制酶XbaI、SalI从pMD18-T载体切下，连接到经相同酶酶切的重组转移质粒pEMOC2上，然后转换提取重组质粒pEM-P1，再将测序正确的T-P2用NotI、XbaI从pMD18-T载体切下，连接到经相同酶酶切的重组转移质粒pEM-P1上去，转化提取质粒鉴定正确，得到重组转移质粒pEM-CpxR。

2 结果与分析

2.1 双组分调控系统CpxA/R基因结构分析

由图1可知，HPS血清5型菌株SH0165测序结果显示，CpxA、CpxR两个基因转录方向一致，基因相靠近，进化比较保守。

2.2 CpxR基因上下游同源臂的扩增

以SH0165菌株基因组为模板扩增CpxR基因的上、下游同源臂，分别为1 030、998 bp。与预期结果大小相同。回收纯化并将目的片段连接到pMD-18T载体上，送上海生工有限公司测序。测序结果表明与公布序列相比相似性为100%（图2、图3）。

2.3 重组转移自杀性质粒pEM-CpxR的构建与鉴定

将测序正确的CpxR基因下游同源臂与自杀性质粒pEMOC2载体用NotI/XbaI双酶切，回收下游同源臂和pEMOC2载体，用T4连接酶进行过夜连接，构建重组转移质粒pEM-P2，并转化DH5α菌株，提取质粒用NotI/XbaI双酶切进行鉴定，显示998 bp左右的目的片段，与下游同源臂相符合，结果表明质粒pEM-P2构建成功（图4）。

然后，再将测序正确CpxR基因上游同源臂与质粒pEM-P2用SalI/XbaI酶进行双酶切，回收纯化上游同源臂和pEMOC2载体，并用T4连接酶进行过夜连接，构建重组转移质粒pEM-CpxR。并转化DH5α菌株，提取质粒，经NotI/SalI双酶切鉴定，与目的片段2 028 bp大小相一致的片段，结果表明，重组自杀性质粒pEM-CpxR构建成功（图5）。

3 讨论

CpxA/CpxR双组分信号转导系统属于OmpR家族，可以通过感应细菌外膜的压力，参与细胞膜蛋白质的折叠以及蛋白质的降解[3]。在杜克雷嗜血杆菌研究中发现，它能够控制毒力相关因子lspB-lspA2、flp、dsrA的表达[4]，CpxA的磷酸化使杜克雷嗜血杆菌的毒力相关因子上调表达[5]。在致病性大肠杆菌和志贺菌属中，CpxA/CpxR能够决定毒力相关因子的表达[6]。Hung等[7]通过构建CpxR突变株，表明CpxA/CpxR能够影响大肠杆菌P菌毛的合成，在缺少葡萄糖培养基中，CpxA-P可以作用于毒力相关因子pap基因的上游从而使该基因上调表达。病原微生物在侵入宿主引起发病过程中，能够通过CpxA/CpxR双组分信号转导系统感受体内外各种信号的变化，继而调节相关基因进行反应以完成其致病过程。因此，CpxA/CpxR双组分信号转导系统在病原菌致病过程中起着重要作用。

本研究在前期工作基础上，拟构建副猪嗜血杆菌双组分信号转导系统CpxA/CpxR两个单基因CpxA、CpxR突变株，详细研究双组分信号转导系统CpxA/CpxR调控副猪嗜血杆菌致病性的机理。探究副猪嗜血杆菌CpxA/CpxR双组分信号转导系统调控致病性的分子机制研究，一方面可以诠释关键生命活动的调控机理，另一方面还可以阐明副猪嗜血杆菌的分子致病机制，为开发副猪嗜血杆菌新型分子疫苗和药物提供基础。

参考文献：

[1] OLVERA A， SEGAL?S J， ARAG?N V. Update on the diagnosis of Haemophilus parasuis infection in pigs and novel genotyping methods [J]. Vet J， 2007， 174（3）：522-529.

[2] CASINO P， MIGUEL-ROMERO L， MARINA A. Visualizing autophosphorylation in histidine kinases[J]. Nat Commun， 2014， 5：3645.

[3] HUNKE S， KELLER R， M?LLER V S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system[J]. FEMS Microbiol Lett， 2012， 326（1）：12-22.

[4] LABANDEIRA-REY M，BRAUTIGAM C A，HANSEN E J. Characterization of the CpxRA regulon in Haemophilus ducreyi[J]. Infect Immun， 2010， 78（11）：4779-4791.

[5] GANGAIAH D， ZHANG X， FORTNEY K R， et al. Activation of CpxRA in Haemophilus ducreyi primarily inhibits the expression of its targets， including major virulence determinants[J]. J Bacteriol， 2013， 195（15），3486-3502.

[6] TOBE T. The roles of two-component systems in virulence of pathogenic Escherichia coli and Shigella spp[J]. Adv Exp Med Biol， 2008， 631：189-199.

[7] HUNG D L， RAIVIO T L， JONES C H，et al. Cpx signaling pathway monitors biogenesis and affects assembly and expression of P pili[J]. EMBO J，2001，20（7）：1508-1518.