一种靶向基因操作新技术

黄俊骏　王华华　梁卫红

摘要：CRISPR/Cas系统是一种细菌在噬菌体长期选择压力下的获得性免疫系统。该系统是一段规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR），具有保护细菌免遭外源DNA入侵的功能。该系统成功地被改造为第三代人工核酸内切酶，由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，目前已成功应用于人类细胞、干细胞、斑马鱼和小鼠以及植物的基因组精确修饰。CRISPR/Cas系统因其在结构上的特殊性以及功能上的特异性正逐渐成为整个生命科学研究领域的热点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。回顾了CRISPR/Cas系统的研究历史，综述了近年来有关CRISPR系统的分类结构、作用机制以及最新应用进展，旨在为这一领域的科研工作提供参考。

关键词：靶向基因操作；规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）；CRISPR/Cas系统；结构；作用机制

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4661-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.002

Abstract：CRISPR/Cas was the elucidation of the prokaryotic adaptive immune system under bacteriophage exerted selection pressure and clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）， which protected bacteria to resist invading foreign DNA. This system was used as a gene-targeting technology to meditate multiple genome. For its easy operation，high efficiency and low cost， currently， this system was also used to modify the genome of human cell， IPS， zebra， mouse and plant by researchers and showed powerful ability to edit gene. CRISPR was becoming a hot spot in the field of bacteriology and was considered that it would replace existing technique because of the unusual structure and specific function.In this paper， we reviewed the history of CRISPR/Cas and summarized the recent research progress in the structure，classification，application and mechanism of the CRISPR. This review will provide the reference value for researchers who are interested in this new technique in their studies.

Key words：gene targeting；clustered regularly interspaced short palindromic repeat；CRISPR/Cas system；structure； mechanism

随着各种基因工程技术的深入开展，人们可以在体外培养的细胞、模式和非模式生物中进行自定义的改动，这类技术为相关研究带来了极大的便利。研究者们能够在这些工具的帮助下敲除基因、引入突变或者构建融合基因，对基因有了更多的了解，以达到为生产实践直接所用之目的。举例来说，人们用酶切割特定的基因组序列，启动细胞的修复过程，并由此作出想要的序列改变，如Meganuclease、锌指酶和TALEN通过各自的DNA结合域来靶向目的序列。但是他们一直无法在基因组中进行精确的定位，因此不能在特定的位点进行这种基因改造。最近，简便而又实用的基因组改造新技术——CRISPR/Cas系统，能成功克服上述缺陷，成为这一领域的新宠儿。该系统使用RNA为核酸酶导航，不仅很容易设计，而且能够改写几乎任何基因组序列。《Nature Methods》杂志在十周年之际推出了纪念特刊，点评了在过去十年中对生物学研究影响最深的十大技术，CRISPR赫然上榜[1]。本文回顾了CRISPR的研究历史，对CRISPR/Cas系统的结构、作用机制和应用进行了综述，对今后该领域的研究进行了展望。

1 关于CRISPR研究的回顾

1987年日本课题组在对一种K12大肠杆菌编码的碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在串联间隔重复序列，而且在该区域的两端还存在一段不太长的特有的序列[2]。随后的研究发现，在已测序的大约40%的细菌和90%的古细菌中都能够观察到这种现象。2002年科学家们将其正式命名为CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），即规律成簇的间隔短回文重复序列[3-5]。起初，由于缺乏病毒和质粒的序列信息，很多科研人员都认为这种CRISPR序列是毫无价值的垃圾DNA，对CRISPR的研究进展缓慢，其行使的确切功能一直未能阐明。2005年3个生物信息学课题组报道称，这些CRISPR的间隔序列DNA与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测CRISPR序列很有可能与细菌的免疫保护机制相关[6-8]。2006年美国研究小组通过生物信息学分析预测，并提出假设，即CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式行使其免疫功能[9]。2007年Barrangou等[10]首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统改变对噬菌体的免疫力，但当时并没有充分意识到CRISPR机制巨大的应用潜力。2008年，Marraffini等[11]又发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能，由此科学家们揭开了研究CRISPR系统作用机制的序幕。2011年Deltcheva团队发现，有一种名为tracrRNA的RNA分子与Cas9蛋白共同作用，负责生成crRNA，该成果发表在《Nature》杂志上[12]，同时推测Cas9、tracrRNA和crRNA一起能够降解与crRNA互补的外源DNA分子。2012年，Jinek等[13]所在的课题组成功地对特定的DNA位点进行了切割。该试验表现出的精准的靶向特性一下子让众多科研人员对CRISPR技术产生了浓厚的兴趣。2013年2月底，国际著名期刊《Cell》报道了加州大学旧金山分校的研究人员发现一种更精确关闭基因的方法，称之CRISPR/Cas9介导的打靶系统[14]。之后，研究者们在包括《Science》和《Nature biotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas系统，并且已成功在人类、小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell）、斑马鱼、水稻、小麦等物种上实现精确的基因修饰[15-18]。CRISPR/Cas基因敲除技术因其可对多种生物的基因组进行遗传改造和在食品发酵工业和医学中的潜在价值，而且操作方法非常简单，吸引着各国科学家们的共同关注，使其成为研究的热点。

2 CRISPR/Cas系统

2.1 CRISPR/Cas系统的结构

CRISPR/Cas系统是细菌在噬菌体的长期选择压力下，进化出的一种较为有效的获得性免疫机制[19，20]。通过在线数据库CRISPRdb和CRISPI的CRISPR序列信息分析发现，接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒中至少存在一个CRISPR基因座[21]。CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族[21，22]，其结构非常稳定，通常由一个前导区（Leader）、多个短而高度保守的正向重复序列区（Repeat）和多个长度相似的间隔区（Spacer）组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT且长度为300～500 bp的区域，这个区域一般来说在种内是比较保守的，但在种间却有显著的差异[3]，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列[9]。重复序列由长度为21～48 bp的碱基组成，其平均长度在31 bp左右，由于含有回文序列，可形成发卡结构[21]。这些重复序列之间被长度为26～72 bp的间隔序列隔开[12，23]。间隔序列由俘获的外源DNA组成[10]，形成了类似免疫记忆。当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的，为宿主细胞提供一种对抗外源基因侵染的能力。在同一个CRISPR位点中，基本上没有相同或比较相似的间区。

通过对CRISPR簇侧翼序列分析发现，在CRISPR位点附近存在着一个保守的多态性家族基因[9，24]，称为CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes， Cas genes）。这些Cas基因是CRISPR免疫防御途径中的基本组成成分，目前发现的Cas基因有多种类型，包括Cas1～Cas10等[25]。该家族基因编码的蛋白质是一种双链DNA核酸酶（具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性），通过位点特异性的切割将入侵DNA切断，从而达到对自身的免疫。CAs蛋白参与CRISPR的转录、加工和外来基因序列的降解等过程，其基因与CRISPR共同进化，构成一个高度保守的系统，进而形成特异性的防御机制，被称为CRISPR干扰[26]。

2.2 CRISPR/Cas系统的作用机制

CRISPR/Cas系统根据Cas位点基因组织源性、参与的Cas蛋白质和序列的不同，可将CRISPR/Cas系统分为I型、II型和III型[9，25，27]。I型CRISPR/Cas系统中Cas蛋白是最多和最复杂的，其中包含有特征性的Cas3蛋白，该蛋白具有解旋酶和核酸酶功能[28]，该系统在细菌和古细菌中都有发现[29]。III型CRISPR/Cas系统包含特征性的Cas10蛋白，其具有RNA酶活性[30]，主要存在于古细菌中[29]。这两个系统具有相似性，即特定的Cas蛋白质内切酶剪切加工转录出的pre-crRNA，加工成熟后的crRNA与多个Cas蛋白质形成复合体识别并剪切与crRNA互补的外源DNA双链序列[12，28，31-36]。而II型CRISPR/Cas系统仅存在于细菌中[29]，并且与上述两种系统存在着截然不同的作用方式，而且只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链。目前II型CRISPR/Cas系统在研究中是最深入的，也是被改造的最为成功的人工核酸酶[10]。

II型CRISPR/Cas系统作为细菌体内的免疫机制，其过程主要包括以下3个阶段得以实现： 第一阶段是CRISPR的高度可变的间隔区的获得。当细菌被外来的噬菌体或质粒入侵时，Cas蛋白复合物识别外源基因组中的特殊片段（该特殊片段很保守，长度一般为25 bp，存在于原型间隔序列的毗邻基序，即Protospacer-associated motif，PAM），靶向裂解和加工原型间隔序列（Protospacer），并将其整合到宿主菌基因组CRISPR位点的5′端的前导序列与第一段重复序列之间[10]，并且每次插入活动都伴随着重复序列的复制，也就意味着CRISPR基因座中的间隔序列从5′到3′的排列记录了外源遗传物质入侵的时间顺序，为适应性免疫奠定了结构基础。第二阶段是CRIPSR基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）。在此阶段，CRISPR基因座首先会被转录成一段长链的CRISPR RNA前体（pre-crRNA），这一前体将会在重复序列处被剪切，然后在Cas内切酶的作用和tracrRNA的指导下被剪切加工成小RNA，也就是成熟crRNA[12，33，37-41]。通常，CRISPR基因座在没有受到外界压力的情况下表达水平很低[37，42]，当外源的噬菌体或是质粒入侵宿主菌时，CRISPR的表达很快被诱导上调[38，39，41，43]。第三阶段是CRISPR/Cas系统活性的发挥或者是对外源遗传物质的切割，该阶段是CRISPR/Cas发挥抵御外源遗传物质入侵最关键的步骤。成熟的crRNA与对应的Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合物，结合并扫描外源DNA，寻找crRNA的间隔序列与外源DNA互补配对的靶序列。核糖核蛋白复合体在配对的特定位置处进行切割，导致入侵质粒或噬菌体DNA降解。研究发现，间隔序列与原间隔序列只需部分互补配对也可以发生切割外源DNA[44-46]。

在细菌体内CRISPR/Cas系统发生免疫的3个阶段中，第一阶段又可称为适应阶段或信息处理阶段，其作用机制在不同的CRISPR/Cas系统中是高度保守的，Cas1和Cas2蛋白作为主要作用蛋白；第二阶段的表达和第三阶段的干扰可合并称为执行阶段，该阶段的作用机制在不同的CRISPR/Cas系统中有较大的差异性，作用蛋白也有所差别[25]。

3 CRISPR/Cas系统的应用

由于II型CRISPR/Cas系统对靶序列的切割只需要4种成分，并且自2013年初首次报道利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞的Th基因实现了定点突变之后[14]，该系统陆续被人们进行改造成为对各种基因组DNA进行靶向修饰的工具[13，17，47-50]。

CRISPR/Cas9技术不同于传统的打靶技术，与其他基因组工程技术相比，则表现出许多优越性：①CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传；②无物种限制，靶向精确性更高，可轻易实现对靶基因多个位点同时敲除；③实验环节少、周期短（最快仅需2个月）、费用低和成功率高；④有可能直接得到纯合子突变体。鉴于以上优势，该技术自发明以来迅速被广大中外研究人员接受而广泛应用于研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点，并且取得了可喜的结果。例如：美国马萨诸塞州综合医院的研究者Mojica等利用该技术，人工合成的sgRNA（Small guide RNA）和构建编码Cas9的T7启动子表达载体，通过显微注射的方式对斑马鱼胚胎基因进行修饰，结果取得了成功。在所有被注射的斑马鱼胚胎内10个切割位点中有8个位点都发生了切割，并且引入了插入或者缺失突变[7]；Wang等[17]将编码Cas9蛋白的mRNA和两条向导RNA分子直接注入了小鼠的受精卵细胞当中，同样成功地敲除了2个基因，成功率达到了80%，并且只需要数周的时间；中国科学院北京遗传及发育生物学研究所Gao的团队利用CRISPR技术已经成功地让OsPDS等4种水稻基因失活，该研究首次证实CRISPR-Cas系统能够用于植物的基因组编辑。随后又利用该技术将小麦中的TaMLO基因敲除，得到了耐白粉病（powdery mildew）的小麦新品种[51]；中国科学院动物研究所的研究人员首次利用CRISPR/Cas系统诱导大鼠的Tet1/Tet2/Tet3基因敲除，实现了效率高达100%的双等位基因纯合突变的单基因敲除和接近60%高效率的3个基因同时敲除大鼠，并且证明CRISPR/Cas系统引入的基因修饰可通过生殖细胞传递到下一代，该技术可推动基因修饰大鼠成为重要的动物模型[52]；中国科学院植物生理生态研究所朱健康实验室用CRISPR/Cas系统分别对拟南芥BRI1、JAZ1、GAI基因和水稻ROC5、SPP、YSA基因进行了定点突变，在拟南芥和水稻中分别采用各自的启动子（CaMV 35S和AtU6-26、CaMV 35S和OsU6-26）表达Cas9基因和gRNA（guide RNA），结果表明CRISPR/Cas系统可以精准地产生位点特异性双链DNA断裂及较高的突变效率，且在T1代获得了纯合突变体[15]；Platt等[53]最近又构建出了一种新的小鼠模型，简化了CRISPR-Cas9系统在体内基因组编辑实验中的应用，并且构建出了最致命的一种人类癌症——肺腺癌的模型；华东师范大学的研究人员通过将RNA直接注入到单细胞胚胎中，利用CRISPR/Cas系统构建出了多个基因突变的大鼠品系，证实在大鼠中Cas9能够高效地介导基因编辑，同时生成复合基因突变体模型[54]。

当然，CRISPR技术也不是尽善尽美的，也存在一定的局限和缺陷。比如我们现在就不清楚向导RNA分子的特异性作用机制。据美国波士顿市麻省总医院的Hwang等介绍，他们的原始试验数据显示，CRISPR技术也存在明显的脱靶效应[16]。同时CRISPR/Cas9对基因组DNA剪切的准确性还有待系统性的评估，如何设计出低脱靶效应，高精准度的CRISPR/Cas系统将是未来研究的重点。

4 展望

CRISPR/Cas系统介导的打靶系统作为一种新型打靶技术，相比其他的基因打靶技术来说具有更多的优势，技术的简便、易用特性以及无限的应用潜力，特别是由其介导的遗传疾病治疗研究为人类基因治疗提供了一条新的思路。当然，今后的研究还需要避免脱靶现象，进一步提高治愈率。同时在整个实验过程中不涉及外源DNA的整合，也就避免了传统转基因技术带来的生物安全问题，因此在动植物新品种培育，尤其是转基因动物的制备中，CRISPR/Cas9介导的打靶系统也将有很大的作为。除此之外，CRISPR技术还有很多其他非常有价值的应用方向。根据实际遗传学操作的需要，CRISPR技术会找到属于它们自己的一席之地。就像Briner等[55]认为的那样，目前CRISPR技术面临的瓶颈就是人类的想象力太有限了。由此看来，细菌受感染之后启动的这套机制为基因工程的研究提供了非常有价值的参考。

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