利用双荧光素酶报告系统鉴定靶向作用猪CD163基因的miRNA

吴俊静　彭先文　乔木等

摘要：为了进一步筛选获得抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）增殖的候选miRNA，为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）防治及猪的抗病育种提供新策略，通过3′RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）测序获得了猪CD163基因3′UTR的完整序列，生物信息学分析发现其具有miR-181c、miR-181d、miR-23b、miR-4262等miRNA的作用靶点。利用双荧光素酶报告系统检测发现，与阴性对照组相比，miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可极显著（P<0.01）抑制荧光素酶的相对活性，其中miR-181d抑制效果最佳。

关键词：双荧光素酶报告系统；miRNA；CD163基因；猪

中图分类号：R318； Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4854-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.052

Abstract： CD163 gene is one of the most important PRRSV entry mediators， which determines the cell susceptibility for PRRSV. If we can identify the miRNAs inhibiting CD163 gene expression， the anti-PRRSV miRNAs can be further acquired. In the present study， we got the full porcine CD163 3′UTR sequence by 3′RACE （Rapid-amplification of cDNA ends） sequencing， and found that it existed targeting sequences of miRNA，including miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262，by bioinformatics analysis. The results of dual luciferase reporter assay showed that miR-181c，miR-181d，miR-23b and miR-4262 could significantly reduced the related luciferase activity of reporter construct compared with the NC control group （P<0.01）， especially for miR-181d. These results indicated that the 4 miRNAs could directly target to porcine CD163 gene，which layed a foundation for the further screening of anti-PRRSV miRNAs in the future.

Key words： dual luciferase reporter system； miRNA； CD163 gene； pig

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的一种危害极大的传染性疾病，因发病猪耳部发绀呈紫红色斑块状，又称蓝耳病，主要导致母猪繁殖障碍（流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等）、各年龄阶段猪的呼吸道症状、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等[1]，造成巨大的经济损失。PRRSV侵入宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合，利用细胞内吞作用感染易感细胞[2]，因此这些特异性受体存在与否决定了细胞对PRRSV的易感性。CD163是PRRSV感染宿主细胞的关键受体之一，参与介导病毒的内吞和增殖。

CD163是一种清道夫受体（Scavenger receptor），在PRRSV感染宿主细胞中起重要作用，主要参与病毒脱壳和基因组RNA的释放过程。在PRRSV非易感细胞系（BHK-21、PK-15、NLFK）中转染CD163真核表达质粒可以使这些细胞系感染 PRRSV 并在细胞内产生子代病毒粒子[3，4]。CD163的表达量高低与PRRSV复制效率呈正相关，上调CD163表达会增加病毒增殖，而下调CD163表达可降低病毒增殖[5]。猪肺泡巨噬细胞（PAM）是PRRSV的天然靶细胞，而采用CD163的抗体可以有效阻止PRRSV感染PAM[3]。永生化的PAM细胞系因无法正常表达CD163而变为PRRSV非易感细胞[6]。CD163是PRRSV感染过程中的关键受体，在PRRSV感染PAM或者是Marc-145细胞的过程中都必须要有CD163的表达。

MicroRNA（miRNA）是一类长约22 bp、高度保守的内源性非编码RNA分子，其表达具有明显的组织和时间特异性，能够互补或部分互补的与靶mRNA结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制。成熟的miRNA可同时封闭多个靶基因的翻译，干预调节miRNA可改变多个靶基因的表达水平，且干预调节效率很高[7]。miRNA在病毒感染和宿主天然免疫中起关键作用，参与病毒与宿主的互作，它有可能是细胞最原始的免疫方式。在小鼠中发现miR-126可通过靶向作用于VEGFR2调控病源引起的天然免疫反应[8]。在人巨噬细胞中，miR-155可靶向作用于SOCSS1，刺激干扰素信号通路下游基因表达，参与抗病毒天然免疫过程[9]。

猪CD163基因在PRRSV感染宿主猪细胞的过程中起关键作用，同时miRNA介导的基因调控对调节机体免疫功能具有重要作用，广泛参与机体抗病毒反应。miRNA多数是通过与靶基因的3′UTR区序列特异性识别来实现对基因表达的调控作用，因此本研究构建了猪CD163基因3′UTR双荧光素酶报告载体，筛选鉴定了靶向调控猪CD163基因的miRNA，可为筛选抑制PRRSV感染增殖的miRNA奠定基础。endprint

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

Marc-145细胞系由华中农业大学保存，用含10%胎牛血清的DMEM培养基对Marc-145细胞进行培养。psi-CHECK2载体、双荧光素酶检测试剂盒、T4 DNA连接酶和感受态大肠杆菌DH5α购自Promega公司；去内毒素质粒小量抽提试剂盒购自Omega公司；Opti-MEM无血清培养基、胎牛血清购自Gibco公司；DMEM培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）购自HyClone公司；Trizol试剂和脂质体（LipofectaminTM 2000）购自Invitrogen公司；3′RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）试剂盒、限制性内切酶XhoⅠ和NotⅠ、Taq DNA聚合酶、dNTP均购自Takara公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；miRNA由上海吉玛制药技术有限公司人工合成。

1.2 猪CD163基因的3′RACE测序

提取湖北白猪（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验猪场）肝脏组织总RNA，使用Takara的3′RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一链。反应体系为10 μL，反应程序为：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min。

参考猪CD163基因GenBank的cDNA序列（登录号：NM_213976.1）设计外、内两个上游特异性引物（外引物：5′-CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC-3′和内引物：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3′），结合Takara 3′RACE试剂盒的外、内两个下游锚定引物（外引物：5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′和内引物：5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′），利用槽式降落PCR扩增3′UTR区片段。第一轮外引物PCR扩增反应体系为50 μL，其中反转录cDNA 2 μL，反应程序为：95 ℃预热4 min；95 ℃变性30 s，62～52 ℃退火30 s（每个循环降低0.5 ℃），72 ℃延伸90 s，共20个循环；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共15个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。第二轮内引物PCR扩增反应体系为50 μL，其中第1轮PCR产物1 μL，反应程序为：95 ℃预热4 min；95 ℃变性30 s，64～54 ℃退火30 s（每个循环降低0.5 ℃），72 ℃延伸90 s，共20个循环；95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72℃延伸90 s，共15个循环；72℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，从琼脂糖回收目的DNA，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

1.3 靶向猪CD163基因3′UTR的miRNA预测

利用生物信息学工具TargenScan，参考人CD163基因3′UTR序列，预测调控CD163基因表达的物种间保守miRNA（miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-23a、miR-23b、miR-23c等）及其作用靶位点序列（TGAATGT和AATGTGA），详见http：//www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_61/view

_gene.cgi？taxid=9606&rs=NM_203416&members=&showcnc=0&shownc=0&showncf=。对比新扩增获得的猪CD163基因3′UTR区序列，发现也包含这些保守miRNAs的靶位点序列（TGAATGT和AATGTGA）。人工合成miR-181c、miR-181d、miR-23a、miR-4262及阴性对照（NC）miRNA模拟物。

1.4 猪CD163基因3′UTR双荧光素酶报告载体的构建

结合猪CD163基因CDS序列和以上3′RACE测序结果，设计包含猪CD163基因3′UTR区的1对引物，PCR扩增猪CD163基因3′UTR区的 469 bp片段。所用引物：上游引物：5′-CCGCTCGAGTCGCT

CATCTTTTGTTGC-3′，含有XhoⅠ酶切识别位点（CTCGAG）和保护碱基（CCG）；下游引物：5′-ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG-3′，含有NotⅠ酶切识别位点（GCGGCCGC）和保护碱基（ATTT）。PCR扩增反应体系为50 μL，反应程序为：95 ℃预热4 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，5个循环；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共25个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR反应产物用1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测，采用过柱离心的方法从琼脂糖回收纯化PCR产物，并对其进行测序验证。

将切胶纯化回收后的PCR产物及psiCHECK-2载体分别用限制性内切酶XhoⅠ和NotⅠ双酶切，然后采用T4 DNA 连接酶将线性化psiCHECK-2载体与CD163基因3′UTR 片段相连，连接体系为10 μL：psi-CHECK2载体2 μL，CD163基因3′UTR扩增片段6 μL，T4连接酶1 μL，10× T4 DNA连接酶缓冲液1 μL。混合体系于4 ℃连接过夜。取5 μL的连接产物连接反应产物转化50 μL感受态大肠杆菌DH5α，采用菌液PCR筛选阳性克隆，并将用XhoⅠ和NotⅠ双酶切正确的重组质粒进行测序鉴定，测序鉴定正确的重组质粒命名为psi-CHECK2-CD163-3UTR。

1.5 荧光素酶活性的检测endprint

在转染前1 d，将5×104个细胞接种在24孔板中，加入无抗生素的培养基培养细胞。转染当天，更换细胞新鲜培养液，用Opti-MEM无血清培养基稀释质粒和脂质体，每孔加入200 ng psi-CHECK2-CD163-3UTR质粒、80 nmol/L各miRNA、2 μL LipofectaminTM 2000脂质体。将细胞培养板放入无菌的5% CO2培养箱中，培养5 h后更换为新鲜完全培养基，24 h后裂解细胞检测荧光素酶活性。上述试验每组设3个平行孔，以不进行转染的细胞作为空白对照，每组试验重复3次。

用冷PBS清洗细胞2次，加入120 μL细胞裂解液1×PLB，室温摇晃15 min充分裂解细胞，然后将裂解液收集至1.5 mL离心管中，按照Promega 公司的双荧光素酶检测试剂盒（Dual-Luciferase Reporter Assay）说明书提供的方法，采用PerkinElmer公司的VICTORTM X2 Multilabel Plate Reader仪器检测双荧光素酶活性。

1.6 数据分析

萤火虫荧光值（M1）为内参荧光值，海肾荧光值（M2）为报告基因检测值，结果以M2与M1的比值（M2/M1）计算，利用SPSS 17.0对检测结果进行统计分析。数据以平均数±标准差表示，检验标准以P<0.05为有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 猪CD163基因的3′RACE测序及分析

miRNA多数是通过与靶基因的3′UTR区序列特异性识别来实现对基因表达的调控作用，而目前GenBank数据库中猪CD163基因的3′UTR序列并不完整，无法进行调控猪CD163基因表达miRNAs的筛选鉴定研究。为了获得猪CD163基因3′UTR的全序列，采用3′RACE结合槽式降落PCR技术，成功扩增获得了猪CD163基因的特异性片段（图1），片段测序结果与GenBank数据库中已知的猪CD163 mRNA序列（NM_213976.1）进行比对分析，获得猪CD163 CDS下游（3′）新的181 bp核苷酸序列，该序列包含PolyA特征的3′UTR核苷酸序列。

利用TargetScan生物学软件预测可调控CD163基因3′UTR区的物种间保守miRNA（miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-23a、miR-23b、miR-23c等）及作用靶位点序列（TGAATGT和AATGTGA），发现新扩增获得的猪3′UTR区也包含这些保守miRNA的作用靶位点序列。

2.2 猪CD163基因3′UTR双荧光素酶报告载体的构建与鉴定

根据获得的猪CD163基因的CDS和3′RACR测序结果，设计包含3′UTR区的1对引物，在5′端和3′端分别引入XhoⅠ和NotⅠ酶切识别位点及保护碱基，利用PCR方法扩增获得了猪CD163基因的469 bp长的目的片段（图2），将该片段插入双荧光素酶报告载体psi-CHECK2的XhoⅠ和NotⅠ酶切位点之间，构建猪CD163基因3′UTR双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK2-CD163-3UTR，构建的载体结构如图3所示。采用菌液PCR鉴定阳性克隆，并用XhoⅠ和NotⅠ限制性内切酶进行双酶切鉴定，证实酶切后得到的469 bp的猪CD163基因3′UTR片段与预期大小相符（图4）。抽提的重组质粒经测序再次验证插入序列的正确性。

2.3 miRNA对猪CD163基因3′UTR的调控

为了检测以上预测的miRNA是否能靶向调控猪CD163基因3′UTR，将psi-CHECK2-CD163-3UTR和相应miRNA模拟物分别共转染Marc-145细胞，采用双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性，结果如表1和图5所示。与NC对照组相比，转染miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262可以极显著（P<0.01）降低双荧光素酶报告载体psi-CHECK2-CD163-3UTR的荧光素酶活性，其中miR-181d抑制效果最佳（降低46%）。说明miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可靶向作用于猪CD163基因3′UTR，对猪CD163基因具有一定的调控作用。

3 小结与讨论

CD163是PRRSV感染宿主细胞的一个关键受体，主要参与病毒脱壳和基因组RNA的释放过程。它由单核细胞-巨噬细胞特异表达，结构包含信号肽、9个串联的SRCR末端重复序列、一个跨膜区以及胞质尾区。2005年Welch等[10]首次发现CD163与PRRSV感染有关，PRRSV非易感系的猪肾细胞表达CD163后，可以被PRRSV感染并产生子代病毒。Calvert等[3]将从各种细胞系中分离得到CDl63分子转染到PRRSV不敏感的细胞系后，这些细胞内都产生子代病毒粒子。并且CD163表达量的高低与PRRSV复制效率呈正相关，上调CD163表达会增加病毒增殖，而下调CD163表达可降低病毒增殖[5]。Ren等[11]发现猪CD163基因CDS区域序列变异与猪PRRSV易感性显著相关。

近几年有文献报道miRNA参与调控PRRSV感染。在人工miRNA方面，Xiao等[12]和Xia等[13]针对PRRSV病毒基因组特点，设计人工miRNA，利用内源性miRNA代谢途径加工成熟后靶向降解PRRSV RNA，从而达到抑制病毒感染的效果。这表明人工miRNA的应用可能成为有效抗PRRSV的新策略。在内源性抗PRRSV增殖的miRNA研究方面，Wang等[14]发现与天然免疫相关的miR-125b能显著抑制PRRSV的RNA复制和病毒增殖，miR-125b并不是直接作用于PRRSV的基因组，而是作用于宿主细胞中NF-κB的抑制因子κB-Ras2，通过调控NF-κB信号通路抑制PRRSV的增殖。endprint

CD163在PRRSV感染宿主细胞过程中具有重要作用，PRRSV必须依赖CD163的表达才能在宿主细胞中繁殖。因此，如果能鉴定获得抑制CD163基因表达的miRNA，就可以进一步筛选获得抑制PRRSV增殖的候选miRNA，为PRRS防治及猪的抗病育种提供新策略。本研究扩增获得了猪CD163基因3′UTR的完整序列，生物信息学分析发现其具有miR-181c、miR-181d、miR-23b、miR-4262等miRNA的作用靶点。利用双荧光素酶报告系统鉴定发现miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262均可靶向作用猪CD163基因的3′UTR，其中miR-181d抑制效果最佳。这4个miRNA也可能是潜在的能抑制PRRSV增殖的miRNA。然而，本结果还需要借助体外细胞学实验进一步验证。

Guo等[15]发现miR-181能与PRRSV RNA非编码序列结合，抑制PRRSV感染，且体内实验证实鼻滴miR-181模拟物可抑制PRRSV在仔猪体内增殖，缓解攻毒后仔猪发病症状。研究还表明宿主miR-181在PAM细胞表达量较低，而在非易感细胞或组织中高表达。在此基础上，Gao等[16]进一步研究发现miR-181能靶向抑制CD163基因表达，从而抑制PRRSV感染，与本研究结果一致。Zhang等[17]研究结果显示，上调表达miR-23能抑制PRRSV感染，而干扰掉内源性miR-23表达会增强PRRSV增殖，表明miR-23具有一定的抗PRRSV增殖效应。他们进一步研究指出miR-23能通过激活IRF3/IRF7诱导产生Ⅰ型干扰素，从而抑制PRRSV感染。然而并未研究miR-23与CD163基因的靶向调控关系，很可能miR-23能通过多种途径（包括抑制受体基因CD163的表达）达到抑制病毒的效果。有关miR-4262的相关研究报道比较少，其功能还不十分明确。

本研究利用双荧光素酶报告系统明确了miR-181c、miR-181d、miR-23b和miR-4262能靶向作用猪CD163基因的3′UTR，对猪CD163基因具有负向调控作用，可为进一步筛选抗PRRSV增殖miRNA奠定基础。

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