茉莉酸调控花药开裂的研究进展

郭航王志敏汤青林田时炳杨洋宋明

（1. 西南大学园艺园林学院 南方山地园艺学教育部重点实验室 重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715；2. 重庆市农业科学院蔬菜花卉所，重庆 400055）

茉莉酸调控花药开裂的研究进展

郭航1王志敏1汤青林1田时炳2杨洋2宋明1

（1. 西南大学园艺园林学院 南方山地园艺学教育部重点实验室 重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715；2. 重庆市农业科学院蔬菜花卉所，重庆 400055）

茉莉酸（JA）是广泛存在于植物中的生长调节物质，JA及其衍生物茉莉酸甲酯（MeJA）在植物生命活动中起着重要作用。JA参与调控雄蕊发育，影响花药开裂，从而影响植物育性。就JA的生物合成及相关基因的表达调控、JA在植物花药发育尤其是后期花药开裂过程中相关基因以及信号转导的分子机制研究进行回顾总结，并对JA调控花药开裂的分子机理研究提出展望。

茉莉酸；花药开裂；分子机制；调控

茉莉酸（Jasmonic acid，JA）及茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）是亚麻酸衍生的具有环戊酮基团的化合物，是广泛存在于植物中的生长调节物质。JA最初从一种真菌中分离得到，早期主要通过外源施加JA或MeJA研究其生理功能，随着分子生物学兴起，人们开始对JA和MeJA的生物合成和代谢的分子调控机理进行研究。JA在植物机体中除了参与植物自身防御系统，还参与植物生长发育，调控种子的萌发和生长、花和果实及花粉的育性等。花药是雄蕊的重要组成部分，花粉成熟后需要通过开裂的花药释放散播，进而完成授粉受精过程。若花药不开裂或开裂过早过晚都会使花粉不能及时释放，从而影响植物育性。JA参与调控植物花药开裂的相关研究始于1996年［1］，在JA合成酶缺陷突变体中观察到花药延迟开裂或不开裂表型。本文从JA调控花药开裂的相关基因、JA信号转导研究、JA诱导的基因表达，以及JA与其他植物激素的相关性等方面，针对近些年来JA参与植物花药开裂过程的分子机制的最新进展作以介绍。

1 JA的生物合成途径

JA的生物合成始于α-亚麻酸LA（Linolenic acid）（图1），它由脂解酶DAD1（Defective in anther dehiscence1）从膜磷脂中释放，在脂氧合酶LOX（lipoxygenase）作用下合成为13-氢过氧化亚麻酸（13-hydroperoxylinolenic acid），之后在丙二烯氧化合酶AOS（Allene oxide synthase）催化下转化为12，13-环氧-十八碳三烯酸（12，13-epoxy-octadecatrienoic acid），接着在丙二烯氧化物环化酶AOC（Allene oxide cyclase）催化下形成12-氧代植二烯酸OPDA（12-oxophytodienoic acid），再经过OPDA还原酶OPR3（12-oxophytodienoic acid reductase）还原和三步β氧化生成JA，最后由它衍生出各种茉莉酸盐（Jasmonates）。

图1 茉莉酸生物合成途径及信号转导模型

以上几个JA合成途径中的关键酶基因的表达对植物体内JA含量影响很大，并且所有编码JA生物合成酶的基因也都受到JA的诱导，这表明JA的生物合成属于正向调节［2］。

2 JA调控花药开裂的相关基因

基于对JA生物合成或信号转导突变体的大量研究，普遍认为JA在调控花药开裂、花丝伸长和花粉发育中扮演重要角色［3］。迄今关于JA调控花药开裂的研究多见于模式植物拟南芥；其次对白菜、油菜、小麦和番茄［4-8］等作物的研究也有相关报道。

2.1 DAD1

DAD1基因编码叶绿体磷脂酶A1（PLA1），催化磷脂转化成亚麻酸，是JA生物合成的初始步骤［9，10］。Ishiguro等［9］首次在拟南芥中克隆到DAD1基因，该DAD1序列无内含子，编码由447个氨基酸残基组成的多肽，具有典型的脂肪酶特征。花芽中的DAD1对JA产生起关键作用，其突变会降低花芽中的JA水平［11-13］。而dad1突变体的损伤叶片中仍有大量JA积累，也说明DAD1并非是唯一参与JA合成的脂肪酶［14，15］。

Ishiguro等［9］通过DAD1 T-DNA插入获得拟南芥雄性不育突变株，该突变体因花药不开裂无法释放花粉，但其他花器包括花药外型都与野生型无差异且雌性可育；回交试验证明该突变为核基因控制的隐性突变；花粉活力检测表明dad1突变体花粉在三核期之前都发育正常，而在最后成熟阶段出现缺陷导致不可育花粉，以上缺陷在对花芽簇施用外源MeJA后得到恢复。Sanders等［16］对拟南芥dad1突变体的研究表明，花药仅在发育9-11阶段响应JA处理。Hatakeyama等［4］对白菜BrDAD1基因进行反义抑制，3株反义基因改造的植株在开花阶段表现出花药开裂缺陷，并产生不能存活花粉；这些雄性不育和开花表型也能通过施用JA和亚麻酸恢复，并且这些特性可遗传给下一代。Chen等［17］以花椰菜为材料研究该基因，也得到相似结果。

花丝中JA合成被认为在一定程度上调节雄蕊和花瓣中水分运输。Ishiguro等［9］认为，DAD1的作用是通过调节JA水平控制水分从药室内壁、结缔组织和药室组织进入维管组织运输，这些依次影响花和花药发育，从而有助于在正确时间花瓣打开和花药开裂。同时提出，花丝和花瓣伸长都是通过DAD1诱导花丝上部区域产生JA开始，从而促进这个区域从子囊腔、药室内壁和结缔组织吸收水分。发育后期阶段，花丝上部和下部的细胞表达DAD1，诱导JA合成并引起从花药细胞壁到花丝的水分输出，导致花丝伸长及随后的花朵开放；推测这是花药开裂所需的细胞层脱水和扩张的原因之一［18］。Ishiguro等［9］还认为，JA通过诱导花药中水分运输基因的表达起作用，如质膜H离子-蔗糖的转运子AtSUC1；它在花药结缔组织周围的薄壁组织中发现，被认为有助于花药壁水分输出［19］。

DAF（DAD1活化因子）编码推定的环指E3泛素连接酶，抑制DAF的表达也会导致花药不开裂、改变花粉发育，从而引起不育。daf突变体花药开裂的细胞基础与dad1突变体类似，DAF通过正向调控DAD1在JA生物合成途径中的表达起作用［20］。

2.2 LOX

LOXs属于双加氧酶（Dioxygenase）家族，在其活性位点上有一个非血红素铁。植物中LOX在亚麻酸9或13位上氧化产生9或13-氢过氧化亚麻酸，分别由LOX-9和LOX-13家族催化［21］。LOX的抑制剂可降低JA的生物合成。Burow等［22］发现两个拟南芥LOX基因，Atlox1在幼苗、花序、根、叶中均有表达，在根和幼苗中表达较高；Atlox2在叶和花序中表达较高；Atlox2蛋白具有叶绿体导肽，被定位于叶绿体。Bannenberg等［23］在拟南芥中克隆到4个编码13-LOXs家族的基因：LOX2、LOX3、LOX4和LOX6，其中LOX2作为合成JA的前体结合次生代谢产物［24，25］，LOX2和LOX6的功能与植物育性无关；而LOX3与LOX4参与花药特异性JA合成［26］和花序构成，它们共享近乎相同的底物结合袋，并且在JA合成上功能冗余［27］。Caldelari等［27］构建拟南芥lox3、lox4双突变体以及aos突变体，lox3、lox4双重突变体和aos突变体都表现出花丝短、柱头长、花药不开裂等花药异常表型，且花粉不可育。而lox3或lox4单突变体具有正常育性。双突变体的雄性不育可通过补充LOX3或LOX4 cDNA的遗传互补来恢复，也可通过外源JA恢复。此外，该双重突变体还表现出异常的花器官发育，这可能是影响到花序分生组织活化终止信号造成的。

2.3 AOS

AOS基因编码的AOS酶是一种羟脂通道酶，是细胞色素P450酶家族成员（CYP74A）。亚麻AOS是第一个被克隆到的该酶的基因，具有叶绿体导肽序列，编码55 kD的蛋白；拟南芥AOS全长基因编码含517个氨基酸、分子量为58.7 kD的蛋白，该基因同样具有叶绿体导肽序列［28］。Maucher等［29］在大麦中克隆到AOS基因AOS1、AOS2，这两个大麦AOS基因不含有叶绿体转运肽，但它们编码的蛋白均共分离于叶绿体。在发育的幼苗中，AOS mRNA大量积累于小盾片的节中，而叶基部积累量很少。

Von Malek等［30］在拟南芥中发现一株花药开裂异常突变株，其突变正是由于AOS酶基因序列内部发生移码造成，该突变株因花药不开裂导致雄性不育，但花粉发育正常，且其育性能被外源JA恢复。Park等［13］对拟南芥AOS敲除突变体和AOS重组表达的研究得出相似结果，在外源施用MeJA和JA生物合成中间产物OPDA后，突变株的雄性不育表型得到恢复，但雄性不育性状在后代中可遗传。Bae等［31］采用RNA干扰技术抑制内源AOS表达，构建花药特异性启动子Osc4和Osg6b控制下的OsAOS1和OsAOS2转基因水稻，部分转基因株表现出严重的雄性不育，分析显示转基因株中AOS在花药中的表达量非常低，认为AOS在花药和花粉发育中起到重要作用。

2.4 AOC

已知的AOC酶催化在9s、13s位上形成12-氧代植二烯酸的专一的对映异构体。Ziegler等［8］在番茄中克隆到AOC基因，其cDNA全长1 kb，编码245个氨基酸的蛋白，分子量约为26 kD，N末端含一个叶绿体导肽。Stenzel等［32］发现受到JA诱导的野生型拟南芥AOC的表达量增加，反之缺乏JA的野生型拟南芥AOC表达量减少，表明JA的生物合成是一个正向反馈调控。

Hause等［33］分析蛋白印迹发现AOC蛋白出现在花原基的所有细胞和组织中。但在开花前不久，AOC蛋白优先出现在胚珠、柱头细胞和维管束中，而在花药和花粉中未检测到。AOC蛋白的积累表明该组织可能合成JA以及JA在花发育的早期阶段起作用，但AOC蛋白未在花药和花粉中积累的原因以及这是否与突变体雄性不育缺陷有关并未明确。

2.5 OPR3

OPR3也称为delayed dehiscence 1（DDE1）［34］，编码OPDA还原酶［（12-oxophytodienoic acid reductase（OPR）］。一些OPDA异构体的生化研究表明，OPR3是拟南芥中唯一能将OPDA还原成JA的OPR酶类［12］。与拟南芥OPR3同源的玉米OPR7和OPR8，被确定为玉米JA生物合成OPR酶［35］。Sanders等［16］的研究表明DDE1（OPR3）基因由4个外显子组成，长1 176 bp，编码391个氨基酸的蛋白序列。野生型植物中，DDE1的mRNA在花药开裂启动前在雌蕊、花瓣和花丝中特异性积累。Li等［36］采用GUS融合技术研究OPR3的时间和空间表达发现，OPR3在根、叶和所有花器中均有表达，主要在叶脉的韧皮部细胞中检测到CUS信号，而在MeJA处理下OPR3表达量大量增加。

拟南芥opr3突变体的花药裂口不正常脱水和开裂延迟，造成雄性不育。研究发现opr3突变体因缺少JA合成所必要OPDA还原酶亚型，使得JA的合成在OPDA和dnOPDA步骤之后受阻。其花药开裂延迟和花粉发育的缺陷可通过施用外源JA得到恢复，施用OPDA则不能，这也说明JA是雄性配子发育所需的活性物质［12，37］。Sanders等［16］的研究中，dde1（opr3）突变体花药开裂延迟或不开裂，花粉具有育性；该突变体花药裂口细胞退化晚于野生型，裂口退化是花药开裂的最后一步，认为是裂口退化延迟引起花药开裂延迟。Sanders等［16，38］还提出JA或其衍生物直接或间接参与调控花药开裂的时间：存在一个花芽感受JA信号的“窗口”，该靶细胞只在花药发育的特定时期（阶段10和11）识别JA信号，从而使花药在开花同时开裂。对DDE1 mRNA的定位检测表明，花药发育后期，DDE1的mRNA大量存在于在雌蕊、花瓣和花丝中，而花药开裂时在参与开裂的组织和细胞，如裂口、隔膜、结缔组织、壁层和表皮中未检测到DDE1的表达，若内源JA在花药中产生，则其是花药发育早期阶段合成的；否则雄蕊、花瓣、花丝也可能是花药中JA信号来源的站点。花药开裂程序启动前就需要JA信号，其作用是定时裂口退化，但在导致裂口退化的一系列过程中，其他步骤或分子机制还有待确定。

Biesgen等［39］则认为这种裂口细胞退化和开裂延迟可能是由于另外两个OPR同工酶OPR1和OPR2的作用，它们主要在拟南芥的根中表达，而在花中表达水平很低；Sanders等［16］也认为这可能是由于JA途径不完全受阻，JA可通过异常的OPR基因家族成员逐步积累；而Farmer等［40］认为这可能与从16∶3脂肪酸合成JA的替代途径有关。

此外，JA代谢途径相关基因脂肪酸脱饱和酶基因FAD（fatty acid desaturase）也直接或间接参与花药开裂的调节：α-亚麻酸是JA合成的前体，一个拟南芥fad3、fad7和fad8三重突变体，缺失将α-亚油酸脱饱和转变为α-亚麻酸的关键同工酶FAD3、FAD7、FAD8，其三烯脂肪酸含量极低，出现花药开裂异常引起雄性不育［2］。

3 JA信号转导研究

JA信 号 转 导 突 变 体coronatine insensitive 1（coi1）也支持JA参与花药开裂的观点。JA受体CORONATINE INSENSITIVE 1（COI1）是一个F-box蛋白，它感知JA，募集茉莉酸ZIM结构域蛋白（Jasmonate ZIM-domain protein，JAZs），形成SCFCOI1-JA-Ile-JAZ三元复合物。JAZ蛋白抑制JA响应基因的转录，三元复合物中的JAZ蛋白泛素化，并通过26S蛋白酶体降解，从而释放下游的转录因子，这些转录因子包括MYB转录因子（MYB21、MYB24和MYB57），bHLH转录因子（MYC2、MYC3和MYC4）及WD-repeat/bHLH/MYB转录复合物，引起下游防御反应或发育调节的转录激活［41］（图1）。COI1蛋白是迄今发现唯一的JA受体［42，43］，JA-ILE也是唯一的SCFCOI1E3泛素连接酶复合物的配体［44］。

coi1突变体花药不开裂引起的不育性不能够通过外源JA恢复［10，45，46］。这是因为JA蛋白在这些信号的存在下不会降解，从而coi1突变体不能响应JAZ和COI1［42］。

Huang等［47］对COI1氨基酸替换突变体的研究表明，不同COI1等位基因突变使不同氨基酸被替换，并对COI1调控雄性育性的功能有不同程度的影响：其中7个替换突变株完全雄性不育，出现花丝不伸长、花药不开裂和花粉败育的表型；coi1-2 突变株育性明显降低；而coi1-8突变株仍保持50%的育性；其原因是由于不同位置氨基酸的改变打乱了COI1的C端结构，影响COI1的稳定性，而不同的突变对COI1稳定性的影响不同，从而影响COI1调解雄性育性的功能。16℃低温处理下，coi1-2突变株的育性得到恢复，虽然低温处理对这些coi1突变体内COI1蛋白水平无明显影响，推测可能是低温调整了突变体COI1的功能（如改变其构型），但是低温是如何调整其构型以形成有功能的COI1来调节雄性育性的还有待进一步明确。

SHI-RELATED SEQUENCE7（SRS7）的活化标记突变体也表现出混乱的花药开裂，产生可育花粉，但不发生绒毡层破裂和花药开裂，这表明绒毡层退化和花药开裂之间有一定的关联；SRS7主要在花丝中表达，并与DAD1在同一时期，SRS7可能参与了JA信号传输［48］。拟南芥中JAR1（JASMONATE RESISTANT 1）是JA信号途径中COI1和MYB21/ MYB24的上游基因，编码JA-氨基酸（JA-amino acid）合成，将JA转变为具有内源生物活性的Jasmonoyl-L-Isoleucine（JA-Ile）［49，50］。Xiao等［51］研究两个水稻JAR1突变体，osjar1-2和osjar1-3，发现由于控制开花的浆片不能及时萎缩，这两个osjar1突变体的颖花在开花期间一直保持开放；充满可育花粉的花药开裂受损，育性降低。从而认为OsJAR1是水稻花朵开闭和花药开裂所必须的。

4 JA诱导的基因表达

JA合成和信号传输在雄蕊发育后期的时序协调中起重要作用。除作用于花原基早期和初期发育的发生［18］，Ito等［52］发现AGAMOUS（AG）在雄蕊发育后期对花药形态发生和开裂、花丝形成和伸长起调节作用；后期发育阶段，AG在一定程度上通过直接调节DAD1的转录和JA的生物合成起作用。

opr3突变体的表达分析在雄蕊中确定了821个基因，有13个转录因子响应JA调控，其中两个转录因子MYB21和MYB24以重叠方式作用调节花药开裂，发现这两个R2R3 MYB蛋白，MYB21和MYB24，是JA引发雄蕊发育过程的关键调节器［53］。拟南芥myb24突变体表型正常；myb21突变体花粉可育，但花丝短、花药开裂延迟，育性降低；myb21、myb24双突变体花丝短，花药和花瓣不打开，可见myb21突变的引入加剧了育性缺陷，外源JA不能恢复myb21和myb21、myb24突变株的育性，这表明作为JA信号元件MYB21和MYB24调解雄蕊发育过程的JA响应［54］；而MYB21过量表达的col1-1或opr3突变体可部分恢复育性［55］。AtMYB21还显示出被光信号运输因子CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC1（COP1）抑 制，COP1是MYB21组织特异性正确表达所需；MYB21直接调节苯丙氨酸裂解酶（PAL）和交替氧化酶（AOX）的表达［56］。AtMYB24在花药发育中的表达受到严格调控，过量表达会导致包括花药发育延迟和不开裂在内的花器缺陷。AtMYB24过量表达株的裂口和隔膜不发生裂解，药室内壁次生增厚量减少，苯丙氨酸途径中基因的表达被破坏［57］。

5 JA与其他植物激素的相关性

有些研究者认为生长素通过JA调节花药开裂。生长素响应因子ARF6和ARF8冗余调节雄蕊发育的晚期阶段［58］，缺失ARF6和ARF8会扰乱JA的生产，从而导致花药开裂延迟或不开裂。arf6-2、afr8-3双突变体的花发育停滞在阶段12，出现花丝不伸长、花药不开裂和花粉败育，这与JA突变体col1-1和opr3的雄性不育表型相同；ARF6和ARF8通过调控DAD1、LOX2、AOS和OPR3基因的表达调节花芽中JA的合成［58-61］，以此影响花药开裂和花粉成熟。经外源JA处理的arf6、arf8双突变体的花芽，其花药发育缺陷可得到恢复，但仍不能使花丝伸长［58，62］。TIR1是一种生长素受体，AFB是生长素信号F-box蛋白，有研究表明，tir1、afb1、afb2和afb3四重突变体花药开裂过早及花粉早熟可能是MYB26和JA积累导致［63，64］。也有人认为上调或下调GT三螺旋DNA-结合转录子的PETAL LOSS-D（PTL-D），通过改变生长素介导途径作用于JA途径［65］。

赤霉素（GA）也通过JA调控后期雄蕊发育。GA受体GID1感知GA信号募集DELLA蛋白泛素化，DELLA蛋白通过26S蛋白酶降解从而激活下游途径响应GA［41］。拟南芥GA缺陷四重突变体ga1-3、gai-t6、rgat2、rgl1-1的小花芽中JA含量比野生型低很多［55］，可见GA通过JA作用，上调DAD1和LOX1，促进JA合成来控制MYB21、MYB24和MYB57的表达，而这些转录因子是花发育12阶段后雄蕊晚期发育所必需的［41，66］。水稻花药发育的基因表达芯片分析表明，314个基因响应GA或JA处理，24个GA和82个JA响应基因在减数分裂和花药成熟阶段的表达量显著变化［67］；GA介导的DELLA蛋白与JAZ蛋白竞争MYC2结合位点，从而影响转录因子MYB21/24/57的活化［26，68］，这些都表明JA和GA途径之间存在相互串扰［26，67-69］。

6 展望

JA与植物生长发育和防御相关。大量研究表明，JA在植物花药发育和最终开裂中起重要调控作用。就目前花药开裂突变体的研究，一般情况下JA途径中任何阶段的缺陷都会引起类似花丝伸长减少、花药开裂延迟或不开裂的表型。对JA生物合成和花药开裂分子调控机制的探讨为JA的研究和揭示植物生殖发育中花药发育机理奠定了一定基础，然而仍有很多值得探索的内容，如已发现和克隆的JA合成和信号转导相关基因只是有限的一部分，仍有大量未知基因；一些JA调控花药发育的作用机理尚属猜测缺少有利证据；JA相关基因、蛋白、酶和转录因子的功能作用尚未详尽阐明；JA途径相关酶的体内定位以及JA受体的研究；JA与生长素、乙烯、赤霉素等生长物质相互的作用机制等，并且目前JA在花药开裂上的研究仅限于少数几种植物且其调控网络还不完整，这些都需要更进一步的探索和研究。

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（责任编辑 狄艳红）

Progress on Regulation of Anther Dehiscence by Jasmonic Acid

Guo Hang1Wang Zhimin1Tang Qinglin1Tian Shibing2Yang yang2Song Ming1
（1. College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University；Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education；Chongqing Key Laboratory of Olericulture，Chongqing 400715；2. The Institute of Vegetables and Flowers，Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400055）

Jasmonic acid（JA） is a ubiquitously occurring plant growth regulator. JA and methyl jasmonate（MeJA） play important role in plant life. JA is involved in stamen development， regulates anther dehiscence and affects plant fertility. This paper reviewed and summarized the JA biosynthesis pathway and the regulation of gene expression， and the molecular research on JA regulates plant anther development，especially anther dehiscence at the late stage. Finally it puts forward some prospects for future study.

jasmonic acid；anther dehiscence；molecular research；regulation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.002

2014-05-23

国家农业部“大宗蔬菜产业技术体系——茄子育种岗位”项目（ARS-25-13C1），中央高校基本科研业务费专项（XDJK2014C0 92），重庆市自然科学基金重点项目（CSTC，2011BA1032）

郭航，女，硕士研究生，研究方向：蔬菜遗传育种与生物技术；E-mail：379639956@qq.com

宋明，男，教授，研究方向：蔬菜遗传育种与生物技术；E-mail：swausongm@163.com王志敏，女，副教授，研究方向：蔬菜遗传育种与生物技术；E-mail：minzniwang_555@163.com