M ntH与含锰过氧化氢酶共表达基因工程菌的构建与发酵优化

王慧崔云风刘岩史吉平赵志军王绍明

（1.石河子大学生命科学学院，石河子　832000；2.中国科学院上海高等研究院，上海　201210）

M ntH与含锰过氧化氢酶共表达基因工程菌的构建与发酵优化

王慧1崔云风1刘岩2史吉平2赵志军2王绍明1

（1.石河子大学生命科学学院，石河子832000；2.中国科学院上海高等研究院，上海201210）

构建Mn2+转运蛋白MntH与来源于Thermus thermophilus HB27的含锰过氧化氢酶的共表达基因工程菌，并进行了发酵培养基及培养环境条件的优化，确定培养基中最佳的碳氮源种类及其浓度分别为：甘油 7.0 g/L，酵母粉 3.75 g/L和蛋白胨 11.25 g/L；当培养基中的Mn2+浓度为1 mmol/L时，最佳的IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L。此外，最佳的培养基初始pH值及培养温度分别为：pH 8.0和37℃，在最优发酵条件下工程菌摇瓶发酵培养24 h，过氧化氢酶活最高可达476 U/mL是未优化前3倍。在5 L发酵罐的验证实验中，过氧化氢酶的酶活进一步提高至1 094 U/mL。

锰过氧化氢酶；转运蛋白；共表达；发酵优化

过氧化氢酶（Catalase，简称CAT），催化H2O2分解为H2O和O2。目前CAT已广泛应用于食品、纺织、造纸和医药等行业，其中在纺织染整工艺中主要用于织物漂白后残余H2O2的消除，与传统化学工艺相比，具有环境友好、面料后续印染质量高等优点［1］。但值得注意的是，印染工序通常是在高温（T＞70℃）碱性（pH＞9）的环境中进行的，这就需要CAT具备嗜热嗜碱的应用特性。而目前市场上仍缺乏具备优良纺织应用特性的CAT［2］。

CAT按蛋白催化中心的结构差异可分为两类：（1）含铁卟啉结构CAT，又称铁过氧化氢酶（FeCAT）；（2）由锰离子代替铁离子的卟啉结构，又称锰过氧化氢酶（MnCAT）［3］。尽管目前已发现的CAT中85%以上属于FeCAT，但近年来研究发现个别来源于高温碱性环境中古细菌的MnCAT具有嗜热嗜碱的优良特性［4-8］。例如，本实验室在前期研究中首次实现了Thermus thermophius HB27来源的MnCAT在大肠杆菌中的异源活性表达，酶学性质研究表明，该Mn-CAT在80℃保温2 h，酶活力不损失；在pH 9.0-11.0的环境中放置2 h，残留酶活在90%以上，具有良好的工业应用潜力［9］。但同时研究发现，该菌株在发酵过程中需添加终浓度为14 mmol/L MnCl2，产酶量才达到最高值25 U/mL［9］。由于MnCAT的蛋白活性中心含有两个Mn2+，因此在培养基中添加Mn2+，对MnCAT三维结构的正确折叠具有关键作用。然而过高浓度的Mn2+也会对菌体生长产生抑制作用，影响到后续的正常发酵；在这种情况下，通过共表达Mn2+转运蛋白MntH提高Mn2+的吸收速率，从而降低蛋白表达对培养基中高浓度Mn2+的需求，可能成为一种解决方案，因此本研究进一步构建MntH与MnCAT的共表达基因工程菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-MnCAT/pACYC-mntH；同时，考察共表达MntH蛋白后培养基中Mn2+浓度变化对MnCAT活性表达的影响。此外，在摇瓶水平上还对该菌株的发酵培养基及培养条件进行优化，并在5 L发酵罐中进行验证实验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 重组大肠杆菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-MnCAT/pACYC-mntH，标记为EC-01，由实验室构建保藏。

1.1.2 培养基 LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。添加1.5%琼脂为LB固体培养基。初始发酵培养基（g/L）：甘油 10，蛋白胨 10，酵母粉 5，K2HPO412.54，KH2PO42.31，FeSO4·7H2O 0.01，MgSO4·7H2O 0.5。

1.1.3 试剂 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素（Kan）和氯霉素（Cm）等试剂购自上海生工生物工程有限公司；酵母粉、蛋白胨购自Oxoid（英国）公司。其它试剂均为国产分析纯。

1.1.4引物根据NCBI 数据库中E. coli BL21（DE3）全基因组序列中的mntH基因序列设计引物，上游引物mntH_F为：5'-CATATGACGAACTA TCGCGTTGAGAGTAGC-3'（下划线部分为限制性内切酶Nde I的识别序列）；下游引物mntH_R为：5'-CTCGAGCTACAATCCCAGCGCCGTC-3'（下划线部分为限制性内切酶Xho I的识别序列），引物由上海生工生物工程有限公司合成纯化。

1.2 方法

1.2.1 重组表达质粒pACYC-mntH的构建与鉴定 以E. coli BL21（DE3）的基因组DNA为模板，利用引物mntH_F和mntH_R，PCR扩增基因mntH的DNA片段；割胶回收PCR产物，体外连接至载体pMD18-T，转化至菌株E. coli DH5α感受态细胞；挑选阳性克隆，提取质粒pMD18-mntH，酶切，电泳鉴定后，由上海生工生物工程有限公司测序，对测序结果进行分析。

质粒pMD18-mntH经Nde I/Xho I双酶切后，与同样经Nde I/Xho I双酶切的载体pACYCDuet-1 DNA片段进行体外T4连接，转化至菌株E. coli DH5α感受态细胞；挑选阳性克隆，提取质粒，双酶切电泳鉴定后，送至上海生工生物工程有限公司测序，对测序结果进行分析。

1.2.2 培养方法 种子培养：取100 μL 保藏于-80℃甘油管中的菌液接入含35 μg/mL Kan和12.5 μg/mL Cm的LB培养基中（50 mL培养基/250 mL三角瓶），于37℃，200 r/min培养8-10 h。

发酵培养：将培养8-10 h的种子以5%的接种量接入含35 μg/mL Kan和12.5 μg/mL Cm的发酵培养基（100 mL培养基/500 mL三角瓶），在37℃、200 r/min培养24 h。

发酵罐培养：5 L发酵罐中装发酵培养基2.5 L，接种量10%，温度37℃，初始搅拌转速300 r/min，自动流加氨水控制pH值在7.0，发酵过程中通过调控搅拌转速和通风量控制溶氧（DO）为30%。

1.2.3 锰过氧化氢酶酶活的测定 参考文献［10］，取1 mL发酵液于12 000 r/min离心3 min，收集菌体，用50 mmol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，重悬于1 mL相同缓冲液中，超声破碎10 min（开5 s，关9 s）后，离心所得上清液即为粗酶液。

采用分光光度法37℃测定CAT的酶活力，反应体积为3 mL，包括0.1 mL的酶液样品和2.9 mL含10 mmol/L H2O2的50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，H2O2的分解速率用紫外分光光度计在240 nm下测定。酶活活力单位（U/mL）的定义为：在37℃、pH 8.0的条件下每分钟分解1 μmol H2O2所需的CAT酶量为一个酶活单位。

2 结果

2.1 重组质粒pACYC-mntH的构建及验证

在转化平板上挑选单菌落，培养过夜后提取质粒pMD18-mntH，用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，得到长度分别约为1 241 bp和2 699 bp的两个片段，大小与预期值相符，测序结果显示与NCBI数据库中的mntH基因序列一致，表明重组质粒pMD18-mntH构建正确。

利用限制性内切酶Nde I和Xho I分别双酶切质粒pMD18-mntH和pACYCDuet-1，连接转化后在平板上挑选单菌落，培养过夜后提取质粒，进行双酶切鉴定。如图1所示，DNA凝胶电泳的结果与预期值相符，表明重组质粒pACYC-mntH构建正确。重组表达质粒pACYC-mntH物理图谱，见图2所示。

图1 重组质粒pACYC-mntH经Nde I/Xho I双酶切的琼脂糖凝胶电泳

图2 重组质粒pACYC-mntH的物理图谱

2.2 mntH和MnCAT共表达基因工程菌的构建

菌株E. coli DH5α/pACYC-mntH在含Cm抗性的LB培养基中过夜培养，提取质粒pACYC-mntH，并将其转化至E. coli BL21（DE3）/pET28a-MnCAT的感受态细胞中，从而获得 mntH和MnCAT共表达基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-MnCAT/pACYC-mntH，标记为EC-01。如图3所示，SDS-PAGE分析验证MntH与MnCAT共表达，蛋白大小与理论值或文献［8］报道一致。

图3 重组大肠杆菌EAC-01的SDS-PAGE分析

2.3 基因工程菌的发酵优化

将基因工程菌EC-01在LB培养基中活化过夜后，按5%转接至含有含35 μg/mL Kan和12.5 μg/mL Cm的发酵初始培养基中，对发酵条件进行优化，考察培养基中的Mn2+添加量、碳氮源、诱导条件、培养温度、初始pH值等对基因工程菌发酵产MnCAT的影响。

2.3.1 Mn2+添加量对重组菌发酵产MnCAT的影响 适量Mn2+的存在是MnCAT蛋白晶体正确三维构象的必要条件，但当Mn2+浓度过高时会抑制菌株的生长。在本研究中，当菌株EC-01在发酵培养基中生长至OD6000.8-1时，添加0.1 mmol/L IPTG进行诱导培养，同时在培养基中分别填加0、1、2、4、6、8、10、12、14和16 mmol/L MnCl2，考察不同Mn2+浓度对重组菌发酵产MnCAT的影响。

如图4所示，当培养液中的Mn2+浓度范围为1-6 mmol/L 时，重组菌发酵产MnCAT的活力较高，其中当Mn2+添加终浓度1 mmol/L时，最终所测得CAT酶活力可达158 U/mL，且在1-6 mmol/L Mn2+浓度范围内，菌体的生长量基本相同。本研究在后续实验中选择1 mmol/L低浓度的Mn2+添加量。

图4 M n2+浓度对重组菌生长及产M nCAT的影响

2.3.2 碳源对重组菌发酵产MnCAT的影响 碳源是菌体合成自身骨架的主要物质，是影响菌体生长和外源基因表达的关键因素之一。本实验中菌株EC-01在碳源分别为总摩尔数相同（以10 g/L的甘油为基准）的可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖和甘油培养基中培养，考察不同碳源对发酵产MnCAT的影响。

如图5所示，菌株EC-01对6种碳源的利用情况差异较大，当分别以甘油、葡萄糖、可溶性淀粉为单一碳源时，菌体培养24 h后的生长量均较高，麦芽糖次之，而蔗糖为碳源时菌体生长量最低；就产酶情况而言，以甘油为碳源时，检测到的CAT酶活力最高，乳糖和蔗糖次之，因此确定甘油为最佳碳源。在此基础上，进一步考察了不同甘油浓度对菌体生长和产酶的影响。

图5 碳源种类对重组菌生长及产MnCAT的影响

由图6所示，当甘油浓度为7 g/L时，检测到的酶活力最高，达到183 U/mL；随着甘油添加量的增加，菌体的生长量缓慢降低，产酶量也呈下降趋势。

图6 甘油浓度对重组菌生长及产M nCAT的影响

2.3.3 氮源对重组菌发酵产MnCAT的影响 菌株EC-01以甘油为碳源，分别以总氮摩尔数相同（以初始培养基中的蛋白胨10 g/L和酵母粉5 g/L为基准）的NH4Cl、（NH4）2SO4、NaNO3、尿素、蛋白胨、酵母粉和玉米浆作为氮源，考察不同氮源对发酵产MnCAT的影响。

图7 氮源种类对重组菌生长及产MnCAT的影响

由图7所示，以蛋白胨为氮源时菌体的产酶量较高；而当以酵母粉为氮源时，菌体的生长量最大；对照培养基中采用蛋白胨和酵母粉复合氮源，此时菌体的生长量和MnCAT产量均比较高；而以其它物质作为单一氮源时，菌体的生长量和产酶量均受到严重影响。在此基础上，进一步考察了在质量总量相同的情况下，考察了不同比例的酵母粉∶蛋白胨配比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5）对菌体生长和产酶的影响。

由图8所示，当酵母粉和蛋白胨的复配比例为1∶1时，菌体的生长量最高；而当酵母粉和蛋白胨的复配比例为1∶3时，菌体的产酶量最高，检测酶活可达223 U/mL，是对照复配比1∶2条件下的1.2倍。综合考虑，在后续的实验中选择酵母粉和蛋白胨的复配比例为1∶3。

图8 酵母粉和蛋白胨复配比例对重组菌生长及产M nCAT的影响

2.3.4 IPTG浓度对重组菌发酵产MnCAT的影响 IPTG作为诱导剂，其浓度对重组蛋白的合成速率和表达水平具有重要影响，本实验选择IPTG诱导浓度分别为0.02、0.05、0.08、0.1、0.15、0.3、0.5 mmol/L，考察IPTG浓度对发酵产MnCAT的影响。

由图9所示，尽管随着IPTG浓度的增加，MnCAT的诱导表达强度会逐渐增强，但IPTG对菌体的毒性作用也逐渐显现；当IPTG浓度大于0.05 mmol/L时，菌体的生长量和产酶量均开始下降，因此，最佳的IPTG诱导浓度为0.05 mmol/L。

图9 IPTG浓度对重组菌生长及产MnCAT的影响

2.3.5 初始诱导菌体浓度对重组菌发酵产MnCAT的影响 由于IPTG具有一定的生理毒性，添加至培养基中时会对菌体的正常生理代谢活动产生影响，因此在添加IPTG前，先让菌体生长至一定菌浓，将有助于重组酶的活性表达。本实验分别选取菌株生长至OD600为1、5、10时，添加0.05 mmol/L IPTG进行诱导培养，这3个OD600值分别处于菌体生长的延滞期、对数生长前期和对数生长后期。

由图10所示，改变初始诱导菌体浓度后，菌体的生长量变化不大，但对菌体的产酶量影响显著。当初始诱导菌体浓度为5时，检测到CAT酶活值达到378 U/mL，是对照条件下（初始诱导菌体浓度为1）时1.7倍，可见在对数生长前期进行IPTG诱导发酵，产酶效果最佳。

图10 初始诱导菌体浓度对重组菌发酵生产MnCAT的影响

2.3.6 温度对重组菌发酵生产MnCAT的影响 当重组菌EC-01在37℃培养至OD600约为5时，添加0.05 mmol/L IPTG，分别选择25℃、30℃、37℃和42℃诱导培养，考察不同诱导温度对重组菌发酵生产MnCAT的影响。

如图11所示，当采用37℃进行诱导发酵时，菌株的产酶量最高，酶活分别是30℃和42℃的4.1倍和1.2倍；当采用25℃进行诱导发酵时，菌株基本不产MnCAT。

2.3.7 初始pH值对重组菌发酵生产MnCAT的影响 改变发酵培养基的初始pH，从而考察不同初始pH对菌体生长和产酶的影响。如图12所示，当初始培养基pH为8时，菌体的生长量和产酶量均最高，检测酶活性可达476 U/mL。

图11 诱导温度对重组菌发酵生产M nCAT的影响

图12 初始pH对重组菌发酵生产M nCAT的影响

2.4 E. coli EC-01在发酵罐中的发酵产酶过程

根据摇瓶发酵优化的最佳营养及环境条件，选择在5 L发酵罐中进行验证；发酵过程中当初始碳源耗尽后，采用pH-stat方式进行了甘油的流加。如图13所示，在发酵0-6 h，菌株生长处于延滞期，之后菌体进入对数生长期；当在对数生长期前期添加IPTG进行诱导后，MnCAT开始大量合成，在发酵12-18 h期间MnCAT快速增加，之后进入缓慢增加的状态，当发酵30 h时，菌体的产酶量最高，检测酶活性可达1 094 U/mL；在发酵30 h以后，菌体进入稳定期；在发酵41 h后，菌体生长进入了衰退期。

图13 重组菌株EC-01发酵产M nCAT的过程曲线

3 讨论

高温嗜碱过氧化氢酶是纺织工业清洁生产的一种重要酶制剂，其菌种选育一直受到研究者的关注。目前，文献报道的CAT主要以FeCAT为主，其酶学性质随筛选环境的不同而显示差异。例如，赵志军等［10］从碱性纺织废水中筛选获得了产过氧化氢酶菌株 Bacillus subtilis WSHDZ-01，其所产CAT的最适pH范围为pH 9.0-11.0，但最适温度范围为30-50℃，属于中温嗜碱酶。而Zeng等［11，12］筛选获得一株产CAT的沙雷氏菌SYBC08，其所产CAT的最适温度范围为50-70℃，但最适pH范围为pH 6.0-8.0属中性酶。与这些FeCAT相比，一些来源于火山口古细菌的MnCAT具有良好的嗜热嗜碱特性。例如，来源于Metallosphaera hakonensis和Thermus thermophius的MnCAT的最适pH最适温度均能满足纺织印染工序环境条件（T＞70℃，pH＞9）的要求［7，8］。

值得的注意的是，尽管上述MnCAT的具有良好的酶学特性，但该类酶目前报道的酶活值最高仅为20-25 U/mL［9］，而已报道的FeCAT酶活值最高可达50 369 U/mL［13］，这主要是由于该类MnCAT的原始菌株筛选至火山口等恶劣环境中，原始菌株的规模化培养存在困难，而其基因工程菌的构建与发酵优化方面的研究才刚刚起步［6］。本研究结果表明，当Mn2+转运蛋白MntH与来源于Thermus thermophilus HB27的MnCAT的进行共表达时，培养基中添加少量的Mn2+就可以满足MnCAT蛋白正确折叠的需求；而同时随着培养液中Mn2+浓度的降低，可大幅降低Mn2+对菌体正常生长的抑制作用，为后续的发酵条件优化研究奠定基础。通过摇瓶培养基和培养条件的优化，菌株的产酶量达到可达476 U/mL，是优化前（158 U/mL）的3倍，是单独表达MnCAT时酶活（25 U/mL）的19倍；当将摇瓶最佳培养基及最佳培养条件在5 L发酵罐中进行验证时，MnCAT的酶活值进一步提高至1094 U/mL，为目前文献报道的大肠杆菌表达该类嗜热耐碱含锰过氧化氢酶的最高酶活水平。这些研究成果表明该类高温嗜碱MnCAT基因工程菌在发酵优化方面仍有较大的提升潜力。

4 结论

本研究成功构建了Mn2+转运蛋白MntH与MnCAT共表达的大肠杆菌基因工程菌，使得MnCAT在低浓度Mn2+培养液中实现了高效活性表达；通过单因素实验进一步优化了发酵培养基组分和发酵环境条件，大幅提高了MnCAT的表达活性，增强了该酶的应用前景。

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［13］ 周丽萍， 过氧化氢酶基因工程菌的构建与发酵优化［D］. 无锡：

江南大学， 2011.

（责任编辑 李楠）

Construction of Co-expressed M ntH and M n-catalase Gene in Escherichia coli and Optim ization of Fermentation Conditions

Wang Hui1Cui Yunfeng1Liu Yan2Shi Jiping2Zhao Zhijun2Wang Shaoming1
（1. College of Life Science，Shihezi University，Shihezi832000；2. Shanghai Advanced Research Institute of Chinese Academy of Sciences，Shanghai201210）

Mn-catalase from Thermus thermophilus HB27 and Mn2+transport protein MntH from Escherichia coli were co-expressed in E. coli BL21（DE3）. The optimization of fermentation medium and environment for the production of Mn-catalase was carried out at the shake flask level. The optimal carbon and nitrogen source were 7.0 g/L glycerine， 3.75 g/L yeast extract and 11.25 g/L peptone respectively. The optimum induced concentration of IPTG was 0.05 mmol/L while the Mn2+in media was 1 mmol/L. In addition， the optimal initial pH of the medium and culture temperature were pH 8.0 and 37℃ respectively. Under the optimal conditions， the maximal activity of catalase reached 476 U/mL， which was 3-fold of the control. Finally， in a 5 L fermentor the activity of catalase increased to 1 094 U/mL.

Mn-catalase；transport protein；co-expression；optimization of fermentation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.026

2015-01-06

国家自然科学基金资助项目（31300048）

王慧，女，硕士，研究方向：酶学；E-mail：wanghui2014xy@126.com

王绍明，男，博士，研究方向：生态学；E-mail：westwild@vip.sina.com