高产铁载体假单胞菌的筛选及其对铁氧化物的利用

朱慧明张彦杨洪江

（1.天津科技大学生物工程学院　工业微生物教育部重点实验室　天津市工业微生物重点实验室，天津　300457；2.天津双联科鑫生物科技有限公司，天津　300403）

高产铁载体假单胞菌的筛选及其对铁氧化物的利用

朱慧明1张彦2杨洪江1

（1.天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室，天津300457；2.天津双联科鑫生物科技有限公司，天津300403）

筛选高产铁载体的微生物，研究铁载体的抑菌作用和对不溶性未定型铁氧化物（poorly crystalline iron hydroxides，PCIH）的利用。CAS法筛选高产铁载体菌株，采用琼脂扩散法和生长抑制测定铁载体的抑菌作用，利用16S rRNA基因序列比对鉴定分离菌株，并根据分离菌株的生长情况，确定铁载体对不溶性PCIH的利用。从土壤样品中共筛选到172株产铁载体的菌株，高产铁载体菌株13株，其中仅有菌株Z158的发酵液对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌具有抑菌作用，抑菌率分别为51.3%、50.2%、37.1%和28.0%。比对该菌株的16S rRNA基因序列，确定Z158属于Pseudomonas aeruginosa。当不溶性的PCIH作为唯一可利用的铁源时，菌株Z158培养24 h的生物量比无铁条件下提高了46.1%。铜绿假单胞菌Z158分泌的铁载体能够抑制病原菌的生长，同时还能获取不溶性未定型铁氧化物PCIH中的铁元素。

铁载体；铜绿假单胞菌；抑菌；未定型铁氧化物

铁元素不仅参与维持微生物细胞内多相体系的渗透平衡，还是微生物代谢过程中多种酶反应的必要成分，铁元素的缺乏能够限制微生物的生长。在中性和碱性条件下，铁元素主要以不溶的矿物质形式存在，难以满足微生物的正常生长。在可溶性铁极度缺乏的环境中，微生物通过合成和分泌铁载体获取铁元素。铁载体是一类特异性螯合Fe3+的金属配体，与Fe3+结合的官能团和中心结构具有多样性，主要包括氧肟酸型、儿茶酚型和多羟基羧酸型［1］。

铁载体对Fe3+具有较高亲和力，与Fe3+形成稳定的络合物，在任何pH值下对不溶性铁矿物质的溶解度都有显著地影响。有研究报道，假单胞菌Pseudomona s sp.和P. mendocin在铁元素缺乏下，能够从不溶性的赤铁矿（Hematite）中获取铁元素维持自身的生长［2，3］。假单胞菌产生的铁载体，不能被本属以外的其它微生物利用，因此能够抑制其它微生物的生长，减少植物根部病原菌的数量；同时，铁载体铁离子络合物也可作为一种铁源被植物利用，促进植物的生长，这些特点使假单胞菌在植物的生物防护中能够发挥重要作用［4］。

为了进一步挖掘微生物资源，本研究从环境中分离了高产铁载体菌株，分析了铁载体对4种常见致病菌的抑制作用，同时还分析了铁载体溶解不溶性未定型铁氧化物（Poorly crystalline iron hydroxides，PCIH）的能力，旨在为生防菌的候选菌株，用于植物细菌性感染的防治和促进植物的生长。

1 材料与方法

1.1 材料

Luria-Bertani（LB）培养基用于细菌的常规培养；Modified Sucrose-Aspartate培养基（MSA）、Modified King B培养基（MKB）、Succinate medium（SM）［5］和Arginine medium（AM）［6］，主要用于细菌铁载体的合成；Chrome Azurol S溶液（固体CAS则需额外添加10 g/L琼脂）［7］，用于检测铁载体。

未定型铁氧化物（Poor crystalline iron hydroxides，PCIH）的制备：0.02 mol/L Fe（NO3）3，快速加入1 mol/L NaOH至pH值为7.0，室温下搅拌24 h，离心，水洗除去大量的Na+和NO3-后，真空冷冻干燥24 h。使用前加入到培养基中，115℃灭菌25 min［8］。

1.2 方法

1.2.1 高产铁载体菌株的筛选 取蓟运河土壤梯度稀释，稀释液涂布在MSA平板上，待菌落长出后覆盖一层CAS蓝色培养基，观察菌落周围颜色变化，15 min内与CAS发生颜色变化的菌株被定义为PSSP（Potentially strong siderophore producers）；而颜色变化不完全或者颜色变化时间超过12 h的菌株被定义为BSP（Borderline siderophore producers）［9］，将菌落周围颜色发生变化的菌株划线纯化。挑单菌落于液体MSA培养基中，30℃、200 r/min培养24 h后，10 000 r/min离心5 min，取等体积无细胞上清与CAS溶液混合，室温下静置1 h，测定OD680［10］。用铁载体活性单位（Siderophore units，SU）表示铁载体的产量，SU=［（Ar-As）/Ar］×100%，Ar是未接种的培养基与等体积CAS混合OD680，As是菌株上清与等体积CAS混合OD680；并对细菌产铁载体能力进行划分，As/Ar从1.0-0之间以0.2为间隔，每减小0.2增加一个“+”，一般产铁载体能力较高的细菌其As/Ar低于0.5［11］。

1.2.2 琼脂扩散法测定PSSP菌株对常见致病菌的抑菌情况 采用琼脂扩散法［12］测定PSSP菌株的抑菌效果，具体步骤是对PSSP菌株单菌落打孔，连同培养基一起取出放置在事先涂布有金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌的MKB平板上，37℃培养12-24 h，测定抑菌圈大小。

1.2.3 菌株的分子鉴定铁载体 按照文献提供的方法提取菌株的基因组DNA［13］，并以此为模板利用通用引物27F和1492R扩增16S rRNA片段，PCR产物纯化后进行序列测定，将得到的序列递交于GenBank，通过Blast检索，在GenBank中的已知序列中进行同源性分析，确定与分离菌株同源程度最高的序列；同时利用Ribosomal Database ProjectⅡ软件Classifer，对分离的菌株进行进一步分类分析；利用MEGA5.0中Neighbor-Joining方法构建系统进化树，确定菌株的进化地位。

1.2.4 液体混合法测定铁载体对常见致病菌的抑菌情况 在MSA培养基中加入FeCl3，使培养基中Fe3+的终浓度分别为0、0.5、1、5、10、100、200μmol/L，30℃、200 r/min培养，每个浓度3个平行，24 h后测定菌株的生长和铁载体产量SU。

Z158在Fe3+终浓度为0和100 μmol/L条件下的发酵液上清以20%的体积加入到已接种指示菌的液体MKB培养基中，同时以只接种指示菌的液体MKB培养基为对照，每组3个平行，16 h后测定指示菌的生长状况OD［11］。

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1.2.5 不同培养基对菌株Z158铁载体产量的影响 MKB培养基、MSA培养基、SM培养基和AM培养基，4种常用于铁载体产生的培养基，同时以LB培养基作对照培养Z158，每组3个平行，24 h后测定Z158在不同培养基中铁载体产量SU。

1.2.6 菌株Z158对不溶性未定型铁氧化物的利用实验 每升培养基中添加1 g 8-羟基喹啉，充分混匀后加入500 mL氯仿萃取8-羟基喹啉，上层无色透明溶液即是无铁SM培养基［14］。在无铁SM培养基中分别加入3种不同形式的铁源，即0.1 g/L不溶性PCIH粉末、终浓度为1 μmol/L Fe3+和终浓度为1 μmol/L EDTA-Fe3+，同时以无铁培养基为对照，每组3个平行，12 h和24 h时测定Z158生长情况和铁载体产量。

本实验使用到的玻璃器皿均用浓盐酸溶液过夜浸泡，然后去离子水清洗3遍。实验中避免使用铁制器械，接种采用铂金丝接种针。

2 结果

2.1 高产铁载体菌株的筛选

利用MSA-CAS平板从土壤样品中共分离到172株产生铁载体的菌株，PSSP（Potentially strong siderophore producers）菌株有13株，BSP（Borderline siderophore producers）菌株有159株。进一步用液体CAS方法定量测定了分离菌株的铁载体产量，发现BSP菌株的SU值均在60%以下，与MSA-CAS平板上BSP菌株的颜色变化缓慢一致；13株PSSP菌株产生铁载体的能力均为++++，其中菌株Z13铁载体产量最大，SU=74.6%（表1）。

表1 分析PSSP菌株产铁载体的水平

2.2 PSSP菌株对常见致病菌的抑制作用

采用琼脂扩散法分析分离菌株的抑菌能力，结果显示，13株PSSP菌株中，10株对普通变形杆菌有抑制作用，2株对金黄色葡萄球菌有抑制作用，1株对副溶血性弧菌有抑制作用，1株对藤黄微球菌有抑制作用。其中菌株Z158对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌4种指示菌都有明显的抑制作用，抑菌圈大小分别为15.0 mm、13.8 mm、10.1 mm和8.9 mm。根据抑菌数据，选择菌株Z158作进一步分析。

菌株Z158在含有0 μmol/L和100 μmol/L Fe3+的培养基中铁载体产量分别为70.8%和19.9%，将两种不同铁载体含量的无细胞上清分别与4种致病菌分别混合培养，结果显示低铁载体含量上清几乎无抑制作用，高铁载体含量上清对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、普通变形杆菌和副溶血性弧菌的抑菌率分别为51.3%、50.2%、37.1%和28.0%（图1）。

图1 菌株Z158不同含量的铁载体对致病菌的抑菌率

2.3 菌株Z158的分子鉴定

根据材料与方法所述，扩增菌株Z158的16S rRNA基因片段，测序后得到扩增的基因片段长度为1 418 bp，上传至GenBank获得的登录号为KP322019。通过Blast检索，与GenBank中的已知序列进行比对，发现与Pseudomonas aeruginosa ALK319同源程度为100%。为了进一步对分离菌株进行分类，利用16S rRNA专业网站Ribosomal Database ProjectⅡ提供的工具Classifier，对Z158的序列进行分析，鉴定该分离菌株与铜绿假单胞菌的同源程度为100%。构建Z158系统进化树（图2），Z158与P. aeruginosa ATCC15692、P. aeruginosa PAO1、P. aeruginosa 4EA和P. aeruginosa ALK319的同源程度高，遗传差异小；其中P. aeruginosa PAO1是典型模式菌株，能产生对Fe3+高亲和力的脓青素（Pyoverdine）；从印度果阿邦分离到的P. aeruginosa 4EA可产生pyochelin和pyoverdine两种铁载体。综合以上结果，鉴定Z158属于铜绿假单胞菌。

图2 Z158系统进化树

2.4 不同培养基对菌株Z158铁载体产量的影响

菌株Z158在5种含有不同碳氮源和微量元素的培养基中的生长和铁载体产量不同，从表2可知，Z158在营养丰富的LB培养基上生长最好，但铁载体含量最低，说明LB适合菌株生长却不适合铁载体的产生；SM、MSA和AM培养基都适合Z158的铁载体产生，综合OD600和SU，我们选择SM培养基作为菌株Z158最适产铁载体的培养基。

表2 不同培养基对Z158生长状况和铁载体产量的影响

图3 Fe3+浓度对铁载体产量的影响

铁载体在不同培养基中的产量不同，可能是培养基中Fe3+浓度的差异造成的。在SM培养基中添加不同浓度的Fe3+，分析铁载体的产量。结果如图3所示，随着培养基中Fe3+浓度的增加，菌株Z158的铁载体产量下降，当Fe3+浓度达到5 μmol/L时，SU降低至17.2%；同时我们还观察到，菌株Z158的铁载体在随着Fe3+浓度增加而减少时培养基的颜色也发生变化，随着Fe3+浓度的增加黄绿色变浅，当Fe3+浓度为5 μmol/L以上时，培养基颜色为白色且不再发生变化。

2.5 菌株Z158对不溶性未定型铁氧化物（PCIH）的利用

铁载体的功能之一是螯合环境中的不溶性铁，为微生物和植物生长所利用。我们在实验室制备了未定型铁化合物PCIH，分析菌株Z158的生长状况。结果如图4所示，菌株Z158在含有0 μmol/L Fe3+、1 μmol/L Fe3+、1 μmol/L EDTA-Fe3+和PCIH培养基中，培养12 h时OD600分别是0.28、0.56、0.53和0.34；24 h时OD600分别为0.24、0.62、0.59和0.36。结果显示，不溶性PCIH能够明显促进菌株Z158的生长，菌株Z158合成分泌的铁载体能够通过溶解螯合作用，从不溶性铁化合物中获取铁元素。

图4 菌株Z158在不同铁源下的生物量

制备无铁培养基时，残留的微量8-羟基喹啉会影响CAS反应的颜色，造成检测铁载体存在误差。研究显示，铜绿假单胞菌产生的铁载体在400 nm左右具有特异吸收峰。我们对发酵液的上清进行全波长扫描发现，在402 nm处也存在特异吸收峰。因此通过测定OD402初步分析发酵液中铁载体的含量。结果如图5所示，在含有PCIH培养基中，铁载体含量较高，仅次于含有1 μmol/L EDTA-Fe3+的培养基。

图5 菌株Z158在不同铁源下的铁载体产量

3 讨论

土壤中含有多种微生物能合成铁载体，本研究筛选到的172株产铁载体菌株，其中PSSP菌株有13株，BSP菌株有159株。进一步用液体CAS方法定量测定分离菌株的铁载体产量，发现PSSP菌株的SU值均在60%以上。Pseudomonas.fluorescens sp-f是目前发现的铁载体产量最大的假单胞菌株，SU值高达90.0%［11］，但菌株的SU值和对致病菌的抑制效果不具有线性关系，也就是说即使SU值很大，也有可能无抑菌作用［15］。例如，从稻田中筛选的能有效地抑制Sarocladium oryza的生长，但SU只有70%左右［16］。文献报道铁载体的抑菌机制主要是：（1）病原菌自己不产生铁载体或产生量小，不能与铁结合或结合能力很弱；（2）生防菌可以利用病原菌产生的铁载体，而病原菌不能利用生防菌产生的铁载体［17］。而且假单胞菌属分泌pyoverdine铁载体，该铁载体不能被本属以外的其他菌株吸收利用，使得假单胞菌在生物防控方面具有很大的优势。本研究筛选到的13株PSSP菌株，只有P. aeruginosa Z158产生的铁载体对4种常见致病菌都有抑制作用。

铁是微生物正常生长所需要的一种重要微量元素，当铁营养供给不足，微生物的生长也受到限制，因此可通过微生物的生长情况反映微生物对不同形式铁源的利用效果［2］。当铁以不溶性矿物质形式存在时，微生物产生的铁载体对不溶性铁矿物质中铁的溶解度和溶解速率极其重要［18］。交替单胞菌Alteromonas haloplanktis产生的铁载体在pH 4.0、ICC=12.9 μmol/L时，使针铁矿和PCIH的溶解速率增大至9.5 nmol/h/m2和3.4 nmol/h/m2［8］；门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina在无铁对照、天然含铁的高岭土和30 μmol/L EDTA-Fe3+中的OD600逐渐增加，但每个细胞分泌的铁载体产量却逐渐降低［19］。本研究中，菌株Z158在PCIH为唯一铁源的培养条件下，产生高于无铁对照的铁载体量促进PCIH中的铁元素的溶解，使12 h和24 h下OD600比无铁条件分别升高了26.6%和46.1%，说明Z158产生的铁载体能促进不溶性PCIH中的铁溶解，进而为自身生长利用。

4 结论

本研究筛选到的P. aeruginosa Z158产生的铁载体可促进不溶性铁化合物的溶解，能够为自身和一些植物的生长提供铁营养，同时还能抑制致病菌的生长，菌株Z158可作为潜在的生防菌株用于植物疾病防控和促进植物的生长。

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（责任编辑 李楠）

Screening of Pseudomonas Strains Producing High-yield Siderophore and Its Utilization of Iron Hydroxides

Zhu Huiming1Zhang Yan2Yang Hongjiang1
（1. College of Biotechnology in Tianjin University of Science and Technology，Key Laboratory of Industrial Microbiology of Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，Tianjin300457；2. Tianjin Shuanglian Kexin Biotechnology Co.，Ltd，Tianjin300453）

The aim of this study is to isolate the microorganisms producing high-yield siderophore， investigate antimicrobial activity of siderophore against pathogenic bacteria， and study the effect of siderophore on the utilization of insoluble poorly crystalline iron hydroxides（PICH）. CAS method was used for isolating microorganisms producing high-yield siderophore. Agar diffusion method and growth inhibition assay were used to test antimicrobial activities of siderophore. Sequence alignment of 16S rRNA gene was used for strain identification. Bacterial growth was measured to investigate the utilization of insoluble PCIH by siderophore. Totally， 172 siderophore-producing strains were isolated from soil samples， including 13 potentially strong siderophore producers（PSSP）. The analysis of antimicrobial activities of siderophore showed that only the supernatant of Z158 culture had a pronounced inhibiting effect on the growth of Staphylococcus aureus， Micrococcus luteus， Proteus vulgaris， and Vibrio parahemolyticus， and the inhibition efficiency was 51.3%， 50.2%， 37.1%， and 28.0%， respectively. Homology analysis of 16S rRNA gene sequence identified strain Z158 as Pseudomonas aeruginosa. Moreover， with insoluble PICH as sole iron source， the biomass of Z158 increased by 46.1% at 24 h after incubation. In conclusion， the siderophore secreted by P. aeruginosa Z158 could inhibit the growth of pathogenic bacteria and acquire iron element from insoluble PCIH.

siderophore；Pseudomonas aeruginosa；antimicrobial activity；poorly crystalline iron hydroxides

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.025

2014-12-24

由天津市科技支撑计划重点项目（13ZCZDNC00600）

朱慧明，女，硕士，研究方向：微生物学；E-mail：zhm15903855271@163.com

杨洪江，男，博士，研究方向：微生物学；E-mail：hongjiangyang@tust.edu.cn