耐盐芽孢杆菌LAY的分类鉴定及其抗白色念珠菌活性研究

曹建斌 于慧瑛 李新

（运城学院生命科学系，运城　044000）

耐盐芽孢杆菌LAY的分类鉴定及其抗白色念珠菌活性研究

曹建斌 于慧瑛 李新

（运城学院生命科学系，运城044000）

旨在从运城盐湖黑泥样品中分离获得一株耐盐细菌LAY，对其进行分类鉴定及抗菌特性研究。基于16S rRNA基因序列对菌株进行分类鉴定。以白色念珠菌为指示菌，采用杯碟法对菌株LAY发酵上清液进行抗菌活性检测，研究不同因素对其抗菌活性的影响；采用扫描电镜和透射电镜观察其抗菌效果，并对菌株基因组进行功能基因的PCR筛查。系统发育分析表明，菌株LAY为Bacillus属成员，为耐盐细菌。电镜观察发现，菌株LAY发酵上清液可导致白色念珠菌细胞结构出现明显异常。抗菌稳定性研究表明，菌株LAY发酵上清液活性较为稳定，表现出良好的对温度、pH、NaCl和紫外光的耐受性。功能基因筛查发现菌株LAY基因组中含有聚酮合酶（PKS）基因，表明该菌具有产聚酮类化合物的潜力。结果表明，盐湖环境中的极端微生物资源可作为抗菌活性物质的潜在新来源。

耐盐细菌；Bacillus；Candida albicans；抗菌活性；功能基因

白色念珠菌（Candida albicans）是念珠菌属中致病力最强的一种革兰氏阳性条件致病菌［1］，常常侵犯人体皮肤、黏膜，并导致内脏或全身感染。近年来，随着大量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用，以及器官移植术的开展，使该菌导致的感染发病率逐渐增高，甚至危及生命［2］。因此寻找和开发具有抗白色念珠菌活性的新化合物，已成为医学和微生物学研究领域的重要课题。

运城盐湖是个典型的内陆咸水湖，由于湖水及其周围土壤的含盐度较高，生活在这类环境中的动植物较为稀少，但却蕴藏着丰富的嗜/耐盐微生物资源［3］。这类微生物对环境的适应能力较强，在长期的进化中逐步形成了独特的种群特点和代谢机制，并产生了许多具有特殊功能的天然活性物质［4］，在食品、医药、环境保护等领域具有重要的开发利用价值［5，6］。近年来，人们虽对盐湖微生物资源开展了大量的研究，但将其应用于抗菌活性筛选的报道却十分有限，仅有少量的嗜/耐盐细菌次生代谢产物被分离纯化，如Halobacillus litoralis YS3106产生的3种具有抗菌作用的环肽［7］和Pelagiobacter variabilis产生的具有抗肿瘤活性的一组吩嗪类化合物［8］。由此可见，盐湖微生物所蕴含的抗菌代谢产物资源还远未被人们所发掘。

本研究从运城盐湖中分离获得一株对白色念珠菌具有明显抗菌活性的菌株LAY，采用16S rRNA基因序列分析对其进行分类鉴定，并对其发酵液抗菌活性进行初步研究。此外，在活性研究的基础上，对菌株LAY基因组进行聚酮合酶（PKS）基因和非核糖体肽合成酶（NRPS）基因的筛查研究，旨在为其在农业生防或医药领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株LAY分离自运城盐湖黑泥样品，白色念珠菌（C. albicans）由本实验室保存。

1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15-20 g，蒸馏水1 000 mL，37℃（培养菌株LAY）。YPD培养基：酵母浸粉20 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，28℃（活化培养白色念珠菌）。

1.2 方法

1.2.1 菌株LAY的16S rRNA基因序列分析及系统进化树构建 提取菌株LAY基因组DNA，采用细菌通用引物进行16S rRNA基因的PCR扩增。正向引物（27f）：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物（1540r）：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃2 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR产物由北京三博远志公司进行测序。测序结果在NCBI 数据库中进行Blast搜索，选择同源性较高的相关序列，利用Clustal W 1.8软件进行多重序列比对后，采用MEGA5.0软件构建菌株LAY的系统进化树。

1.2.2 白色念珠菌的活化及菌株LAY发酵上清液的制备 从斜面上挑取适量的白色念珠菌菌苔，接入已灭菌的YPD培养基，28℃下振荡培养2 d。菌株LAY于37℃振荡培养3 d，发酵液经12 000 r/min离心10 min，上清液用于抗菌活性检测。

1.2.3 抗菌活性检测

1.2.3.1 热稳定性 将5 mL上清液分别置于30、40、50、60、70、80、90和100℃下处理30 min，以白色念珠菌为指示菌，未处理的发酵上清为对照，采用杯碟法测定抑菌圈直径，检测其热稳定性。

1.2.3.2 pH稳定性 取发酵上清液，将其pH值分别调为4、5、6、7、8、9、10、11和12的溶液，后均定容至5 mL，静置2 h。采用杯碟法检测其酸碱稳定性。

1.2.3.3 NaCl稳定性 取1 mL上清液，加入NaCl溶液，分别调节盐浓度为3%、6%、9%、12%、15%和18%，静置2 h。采用杯碟法测定其对NaCl的稳定性。

1.2.3.4 紫外光照稳定性 取5 mL菌株LAY发酵上清液置于紫外灯下，分别于0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5 h取样，以白色念珠菌为指示菌，未处理的发酵上清为对照，采用杯碟法测定其光照稳定性。

1.2.4 电镜观察 取1 mL活化的白色念珠菌悬液（108CFU/mL），加入2 mL发酵上清液，28℃，120 r/min振荡培养24 h，离心收集细胞，用磷酸缓冲液（pH7.4）冲洗，加入2.5%（V/V）的戊二醛溶液进行固定。细胞样品经处理后，分别在扫描电镜（JSH-35CF，日本）和透射电镜（DXB2-12，上海）下进行观察。

1.2.5 菌株LAY生长曲线与抗生素产生量的关系 以1%的接种量将菌株LAY接种于PDA培养基中，于37℃下振荡培养。在培养2 h后，每隔2 h测OD600值，以PDA培养基做空白对照。同时，取1 mL菌液，于12 000 r/min离心10 min，取上清液，用于抗菌活性检测。

1.2.6 功能基因的PCR筛查及序列分析 采用Zhu等［9］设计的特异引物，对菌株LAY基因组进行聚酮合酶（PKS）和非核糖体肽合成酶（NRPS）基因的PCR筛查。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，进行回收纯化、酶连及转化。挑取阳性克隆由北京三博远志生物公司进行测序。将获得的基因序列提交到GenBank中获得基因登录号。采用DNAman软件将获得的基因序列转换为氨基酸序列，在GenBank数据库中进行Blast比对分析，选取同源性较高的相关序列，采用MEGA5.0软件进行系统发育分析。

2 结果

2.1 菌株LAY的分类鉴定

2.1.1 部分生理生化特征 如图1所示，菌株LAY在0-25.0%的盐浓度范围内均能生长，最适生长浓度为5%，确定其为耐盐细菌；菌株生长的最适pH和温度分别为pH7.0和35℃。

图1 NaCl浓度（A）、pH（B）和温度（C）对菌株LAY生长特性的影响

2.1.2 系统进化树构建 采用PCR 扩增菌株LAY的16S rRNA基因，获得大小为1 449 bp的片段。采用邻接法构建的系统进化树。结果（图2）显示，菌株LAY与Bacillus属内各种的同源性均在98.0%以上，确定其为Bacillus属成员，命名为Bacillus sp. LAY。

图2 基于16S rRNA基因序列构建的菌株LAY的系统发育树

2.2 菌株LAY发酵液抗白色念珠菌活性研究

2.2.1 抗菌活性检测 采用杯碟法检测菌株LAY发酵上清液的抗菌活性，结果（图3）表明该菌可产生胞外抗菌物质，对白色念珠菌具有明显的抑制作用。

2.2.2 抗菌稳定性研究 热稳定性（图4-A）结果表明，在70℃以下，抗菌活性较为稳定；80℃时，抗菌活性最佳；温度高于90℃，抗菌活性开始有所下降。在pH11时，上清液对白色念珠菌的抗菌活性最强。pH为4-10时，抗菌活性比较稳定。在pH12时，抗菌活性明显下降。结果（图4-B）表明，菌株LAY发酵液的抗菌活性对酸碱的耐受性较好。盐稳定性结果（图4-C）表明，菌株LAY抗菌活性在盐度为0-3%时最高。但随着盐度的升高，抗菌活性不断下降，当盐浓度超过15%时，抗菌活性基本消失。此外，研究发现，菌株LAY发酵上清液具有良好的对紫外光的稳定性（图4-D）。

图3 菌株LAY发酵液抗菌活性检测

图4 菌株LAY发酵上清液的抗菌特性

2.3 电镜观察

采用扫描电镜观察菌株LAY上清液对白色念珠菌的抗菌作用，如图5所示。正常白色念珠菌细胞形状规则，呈圆球形，表面较为光滑，直径约为2-4 μm（图5-A）。经上清液处理后的细胞形态发生明显变化，细胞表面粗糙并出现裂纹，且部分细胞发生破裂（图5-B）。

透射电镜观察发现，正常细胞内结构规则，细胞质分布均匀，细胞壁厚度约为150-200 nm，且细胞质中含有丰富的电子致密物质（图6-A）。经处理后的细胞发生明显改变，胞内结构紊乱，部分细胞胞壁疑似消失（图6-B）或增厚（图6-C）。此外，发现细胞质与细胞壁的界限变得模糊，且无法直接观察到细胞核的存在（图6-C）。

图5 扫描电镜观察

图6 透射电镜观察

2.4 菌株LAY生长曲线与抗生素产生量的关系

如图7所示，菌株LAY在培养开始后即进入对数生长期，30 h后达到峰值，并随后进入稳定期（30-46 h）。由于菌株LAY产生抗菌物质的量与抑菌圈直径的大小成正比，抗菌物质在菌株培养18 h后开始产生，32 h后产生量最高，后趋于稳定。

图7 菌株LAY生长曲线与抗生素产生量的关系

2.5 功能基因的PCR筛查与分析

对菌株LAY基因组进行聚酮合酶（PKS）和非核糖体肽合成酶（NRPS）基因PCR筛查，结果发现该菌株基因组中不存在NRPS基因，但发现了PKS基因的存在。经测序后，获得一条666 bp的PKS基因片段，提交到GenBank中获得基因登录号为KM000039。将获得的基因片段转换为氨基酸序列（AIO09649），进行Blastx比对，发现该序列与GenBank中已有序列的最高相似度为99%。系统发育分析表明，菌株LAY的PKS基因序列编码的氨基酸序列为酮缩合酶（KS）基因的高度保守序列（图8）。

3 讨论

作为一类重要的药源性微生物资源，芽孢杆菌具有产丰富次生代谢产物的巨大潜力，它们易于繁殖，分布广泛，适应环境能力强，在工业、农业、医学等领域具有广阔的开发利用价值［10］。近年来，随着陆地微生物资源的日益匮乏和细菌耐药性问题的不断出现，寻找新种属或特殊性状的微生物来开拓微生物筛选的新资源显得尤为迫切。因此，从极端环境中寻找和发现具有抗菌活性的特殊菌株就成为研究者关注的新热点［11］。多年来，本课题组针对运城盐湖的微生物资源，开展了大量的调查研究工作，筛选并获得了一批具有明显抗菌活性的盐湖芽孢杆菌菌株。本研究针对其中一株具有抗白色念珠菌活性的耐盐细菌菌株LAY进行研究，通过基因序列分析发现其为Bacillus属成员。

图8 基于氨基酸序列的PKS基因的系统进化树

由微生物产生的聚酮类化合物（Polyketide）和非核糖体肽类化合物（Non-ribosomal peptide）是天然化合物的两大重要家族，它们大多具有良好的生物学活性，被广泛用于医用或农用抗生素、免疫抑制剂和抗癌药等［12］。目前已报道的聚酮类化合物和非核糖体肽类化合物可达数万种，主要来源于各种细菌、放线菌和真菌［13］。对此，本研究采用PCR技术主要开展了菌株LAY基因组中的PKS基因和NRPS基因的分子筛查，结果发现Bacillus sp. LAY也具有产聚酮类化合物的潜力。近年来，在耐盐细菌的许多常见种群中，如Aeromonas，Burkholderia，Photobacterium，Pseudomonas等，均发现了具有抗菌活性菌株的存在［14-16］，但对其次级代谢产物的报道却相对较少。

本研究表明，菌株LAY发酵上清液对白色念珠菌具有明显的抗菌活性。同时，对其发酵上清液进行各种处理后，发现其抗菌活性表现出对紫外光照、热、环境酸碱度等良好的稳定性，因此可能具有广阔的应用潜力。细胞壁是真菌细胞外的重要结构，在维持细胞的生长和正常的生理功能上发挥重要作用。由于哺乳动物无细胞壁，因而作用于真菌细胞壁的药物具有高效、低毒的特点。通过电镜观察，发现经菌株LAY发酵上清液处理后的真菌细胞出现破裂或变形。Leite等［17］报道该现象主要是由于化合物导致细胞渗透性发生变化引起的，而这可能源于抗菌物质的作用靶点为真菌细胞膜或细胞壁。该结果表明，菌株LAY可能产生了某种可破坏真菌细胞壁的抗菌物质。

通过长期的自然选择与进化，生长在盐（碱）湖、海水等盐域环境中的微生物形成了独特的环境适应机制，极有可能会产生某些具有独特化学结构或生物学活性的代谢产物，因此可作为发现新型天然化合物的潜在资源。随着科学研究的广泛开展，来源于极端环境中的抗菌活性微生物也将被不断发现和鉴定。在本研究结果的基础上，今后将着重针对菌株LAY所产代谢产物进行分离纯化及结构解析等相关工作，为其在农业生防或医药领域的应用奠定基础。

4 结论

本研究从运城盐湖黑泥样品中筛选获得一株对白色念珠菌具有明显抗菌活性的菌株LAY，通过16S rRNA基因序列分析鉴定其为Bacillus属成员。抗菌活性研究结果表明，菌株LAY发酵上清液活性较为稳定，表现出良好的耐热性、抗酸碱及耐盐性等。抗菌上清液处理白色念珠菌后，可导致其细胞结构出现明显异常。通过功能基因的PCR筛查，发现Bacillus sp. LAY基因组中含有聚酮合酶（PKS）基因，表明该菌可产聚酮类化合物的。综合上述研究表明，盐域环境中的嗜/耐盐微生物资源可能是获得新型抗菌活性物质的重要资源。

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（责任编辑 马鑫）

Identification of Bacillus sp. LAY and Its Antim icrobial Activity Against Candida albicans

Cao Jianbin Yu Huiying Li Xin
（College of Life Sciences，Yuncheng University，Yuncheng044000）

The goal of this work is to identify a halotolerant bacterium LAY isolated from Yuncheng Salt Lake and study its antimicrobial properties. The strain LAY was identified by 16S rRNA gene sequence analysis. Using Candida albicans as the indicator， the antimicrobial activity of the fermentation broth of strain LAY was detected by cylinder plate method， and meanwhile the effects of different factors on the activities were studied. Morphological and ultra-structural changes of treated cells were observed by scanning electron microscopy（SEM）and transmission electron microscopy（TEM）. PCR screening of functional genes were also carried out. The results of phylogenetic analysis indicated that it was a halotolerant bacterium， and characterized as the genus of Bacillus， and named as Bacillus sp. LAY. The observation by electron spectroscopy discovered that morphological and ultra-structural changes of C. albicans after treatment by fermentation broth of Bacillus sp. LAY were significant. Antimicrobial properties of the strain LAY indicated that the activity of fermentation broth was stable， and showed excellent tolerance towards temperature， pH， NaCl and ultraviolet. Using specific primers， a gene for polyketide synthase（PKS）was detected by PCR technique， indicating that the strain LAY possessed the potential of producing polyketide. In conclusion， results from the study showed that extremophiles from salt lake might be developed as a potential new source of antimicrobial active substances.

halotolerant bacteria；Bacillus；Candida albicans；antimicrobial activity；functional gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.023

2015-01-14

国家青年科学基金项目（31300002），运城学院博士启动基金项目（YQ-2011043）

曹建斌，男，硕士，讲师，研究方向：分子生物学；E-mail：caojianbin2006@126.com

李新，男，博士，副教授，研究方向：极端微生物学；E-mail：lixin-eva@163.com