檀香炭疽病拮抗细菌的分离筛选及鉴定

田媛媛 周国英 左杰 刘倩丽 杨权

（中南林业科技大学　经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，长沙　410004）

檀香炭疽病拮抗细菌的分离筛选及鉴定

田媛媛 周国英 左杰 刘倩丽 杨权

（中南林业科技大学经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，长沙410004）

旨在从海南省国营澄迈林场的土壤中筛选出对檀香炭疽病具有较强生防效果的拮抗细菌。采集澄迈林场檀香不同种植区中优良单株的根际土壤，通过稀释平板法从中分离出71株细菌，以檀香炭疽病原菌为靶标菌，通过平板对峙法初筛和发酵液法复筛，获得一株具较强拮抗效果的细菌，编号为TXJ2-6；抗菌谱测定表明，该拮抗菌株对降香黄檀炭疽病、油茶软腐病、油茶叶枯病、油茶根腐病、油茶炭疽病5种病原真菌也具有明显拮抗效果；通过形态学观察、生理生化特性及16S rDNA序列分析，鉴定该拮抗菌株为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。

檀香；炭疽病；拮抗细菌；筛选；鉴定

檀香（Santalum album Linn.）隶属于檀香科檀香属，是一种半寄生小乔木，其用途广泛，经济价值极高，是世界上最昂贵的木材之一。檀香集芳香、药用、材用于一身，被誉为“绿色金子”、“香料之王”［1］。目前，为满足我国国内的需求，并且经过多年栽培推广，在广东、海南、四川、云南、广西、福建及浙江等地引种栽培了一定规模的檀香［2-6］。海南省在开展了“绿化宝岛”大行动后，檀香的人工林种植面积明显增加［7］。然而2013年在对海南省檀香病虫害调查结果中发现，檀香的主要病害有炭疽病、苗木立枯病、煤污病、根腐病、白粉病等，其中炭疽病是危害檀香幼树生长的主要病害，并且在近年趋重发生。发病初期叶片会出现紫色或紫褐色病斑，严重时导致檀香叶片大量提前落叶，对檀香的健康生长造成严重影响，因此对檀香病害的研究与防治具有重要意义。

目前主要通过化学杀菌剂控制该病害，这种方法容易导致病原菌抗药性，甚至会污染环境。生物制剂具有无污染，无公害，无残留，不易形成抗性等特点［8］，也是当今国内外病害防控研究的热点。应用拮抗微生物防治檀香炭疽病害在国内外尚未有报道，本研究拟从檀香优良单株根际土壤中分离筛选出有效控制檀香炭疽病的生防细菌，以期为檀香炭疽病的生物防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试病原菌 檀香炭疽病的病原菌（Colletotrichum fructicola），编号SA-2，由本实验室分离鉴定并保存。供试5种病原菌，即降香黄檀炭疽病、油茶叶枯病菌、油茶软腐病菌、油茶根腐病和油茶炭疽病，均由经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室提供。

1.1.2 土样来源 海南省国营澄迈林场，采集不同种植区中檀香优良单株的根际土壤，编号封存于封口袋中，带回实验室进行细菌的分离。

1.1.3 供试培养基 PDA培养基［9］（用于植物病原真菌培养及菌株拮抗效果测定）：马铃薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂 15.0-20.0 g，蒸馏水1 000 mL；NA培养基［10］（用于拮抗细菌分离纯化培养）：蛋白胨 10.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，琼脂15.0-20.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.2-7.4；NB培养基［11］（用于拮抗细菌液体培养）：蛋白胨 10.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.2-7.4。

1.2 方法

1.2.1 根际细菌的分离 称取檀香优良单株的新鲜根际土样10.0 g放入装有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡20 min，制成土壤悬液（10-1）。从中取1 mL土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-2）。依此类推制成10-3、10-4、10-5、10-6和10-7各种稀释度的土壤溶液备用。

分别吸取上述不同稀释度的土壤溶液 0.1 mL 至准备好的NA平板上，均匀涂布。细菌一般培养温度为35-37℃，故选择35℃下进行恒温培养，48 h后记录菌量，然后根据菌落形态、颜色、透明度、边缘、干湿等特征，挑取性状不同的菌落，在NA平板上进行划线纯化、编号、培养，再4℃保存备用［12，13］，共分离3个批次的生防细菌。分离出的细菌于28℃和35℃下均可正常生长。

1.2.2 拮抗菌的筛选 采用平板对峙法［14］初筛，在PDA平板中央接直径6 mm的供试病原菌菌块，在距菌块3 cm处对角线接种土壤中已分离纯化的细菌菌株，以只接种病原菌菌块为对照。每组设置3个重复，在28℃恒温培养，5 d后观测抑菌圈大小，筛选出对檀香炭疽病菌有抑制作用的拮抗细菌。

采用发酵液法［15］复筛，将6种初筛选出的拮抗菌株培养2 d后接种到50 mL NA培养液的三角瓶（250 mL）中，30℃、160 r/min摇床振荡培养48 h。发酵液经0.22 μm细菌过滤器过滤得到发酵滤液，将滤液与PDA 培养基按 1∶19混匀后倒平板，中央接檀香炭疽病原菌，以蒸馏水代替滤液为对照。每组设置3个重复，28℃恒温培养，5 d后观测抑菌圈大小。

1.2.3 拮抗细菌抗菌谱的测定 采用平板对峙法，在离病原菌菌块中心 3 cm 处对角线接种4点待测拮抗细菌，以中央接病原菌作对照；28℃恒温培养6 d。每处理 3 次重复。测量病原菌菌落直径和抑菌带宽度，计算拮抗菌对各供试病菌的抑菌率。

抑制率（%）=［（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-原菌饼直径）］×100%

1.2.4 拮抗菌株的鉴定

1.2.4.1 形态特征 拮抗细菌经无菌水稀释适当浓度后，接种于NA 培养基上，于35℃恒温培养2-3 d，长出单菌落后，观察记录菌落形态［10］。同时，对菌体进行革兰氏染色，显微镜下观察其菌体形态以及大小。

1.2.4.2 生理生化特性测定 参照《常见细菌系统鉴定手册》［16］和《伯杰细菌鉴定手册》［17］的方法，进行拮抗细菌常规生理生化反应测定。

1.2.4.3 分子生物学鉴定 将培养3 d的拮抗菌株接种到40 mL NB培养液的三角瓶（100 mL）中，于35℃、160 r/min，恒温振荡培养48 h后制成菌体悬浮液，离心收集菌体，采用常规CTAB法［18］用DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取病原菌基因组DNA。采用细菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对提取的DNA进行PCR扩增。

将扩增后的DNA产物送至上海生工生物有限公司进行纯化测序。并且把测序结果与GenBank中的序列进行blast比对。以16S rDNA相似序列，利用MEGA5.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果

2.1 拮抗细菌的分离与筛选

从海南省国营澄迈林场檀香优良单株的根际土壤中，3个批次共分离得到71株细菌。以檀香炭疽病原菌为指示菌，筛选出抑菌带宽度D≥6 mm的拮抗菌6株，分别为TXJ1-11、TXJ1-17、TXJ2-6、TXJ2-23、TXJ3-14和TXJ3-17（表1）。筛选出的6株拮抗细菌经发酵液法复筛，得到TXJ2-6菌株的抑菌效果最好，抑菌率为76.9%（表2）。 因此，将TXJ2-6作为檀香炭疽病的拮抗菌株进行后续实验。

表1 拮抗细菌对檀香炭疽病菌的抑制作用

表2 拮抗细菌发酵液对檀香炭疽病菌的抑制作用

在PDA平板对峙法中，接种TXJ2-6菌株后，拮抗菌对檀香炭疽病菌SA-2具有明显的抑菌带，病原菌菌丝生长受到较明显抑制，并且在病原菌菌落的边缘与抑菌带接触部位的菌丝发生溶解，整个菌落的生长受到明显抑制（图1）。

图1 菌株TXJ2-6对檀香炭疽病病原菌的拮抗作用

2.2 拮抗细菌抗菌谱实验结果

由表3可知，拮抗细菌TXJ2-6对5种病原真菌，即降香黄檀炭疽病菌、油茶软腐病菌、油茶叶枯病菌、油茶根腐病菌及油茶炭疽病菌均有抑菌作用，其中对降香黄檀炭疽病菌、油茶软腐病菌和油茶炭疽病菌的抑菌率分别达到77.8%、75.6%和75.6%。因此，可初步说明TXJ2-6菌株对植物病原真菌有一定的广谱性，具有生防应用前景。

表3 拮抗细菌TXJ2-6对5种病原真菌的抑制作用

2.3 拮抗菌株的鉴定

2.3.1 形态特征 图2显示，菌株TXJ2-6在牛肉膏蛋白胨培养基上呈乳白色菌落，圆形或近圆形，表面湿润不透明，边缘波状，有褶皱。菌体呈杆状，芽孢中生，孢囊不膨大，革兰氏染色呈阳性（图2）。

图2 TXJ2-6的形态特征

2.3.2 生理生化特征 通过对菌株TXJ2-6的部分生理生化特性实验（表4）结果并结合其形态特征，对照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，初步鉴定TXJ2-6菌株为芽孢杆菌属。

表4 TXJ2-6的生理生化特征

2.3.3 分子生物学鉴定 以TXJ2-6基因组DNA为模板，用通用引物27F和1492R对16S rDNA序列进行PCR扩增，将获得的扩增产物进行测序，得到大小为1 411 bp的核苷酸序列。将该序列通过BLAST程序与 GenBank中序列进行对比分析，结果显示菌株TXJ2-6与其比对的芽孢杆菌属同源，相似度高达100%，采用MEGA5.0软件以GenBank中16S rDNA相似序列及其模式菌株16S rDNA序列构建系统进化树。结果（图3）表明，菌株TXJ2-6与菌株SK13（GenBank 登录号KC790303.1）和菌株PY1（GenBank登录号KC790265.1 ）的亲缘关系最近，且此两株菌均为甲基营养型芽孢杆菌菌综合菌株的形态学特征、生理生化特征及分子生物学鉴定，拮抗菌株可初步鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。

3 讨论

对海南省檀香的病害普查结果发现，炭疽病是檀香苗木及其幼树生长的主要病害，目前此病害的林间防治方法主要是化学防治，即在病害发生的早期，交替使用多菌灵、甲基托布津、波尔多液等药剂。但是，化学药剂的预防作用很好，治疗作用效果较差。另外，芽孢杆菌具有较强的抗菌防病功能，已成功作为生物农药用于植物病害的生物防治［18，19］。目前关于檀香炭疽病及其防治尚无相关报道和系统研究。本实验首次将甲基营养型芽孢杆菌用于该病的生物防治，同时，该菌株拮抗作用具有一定的广谱性，对油茶软腐病、油茶叶枯病、油茶根腐病、油茶炭疽病和热带树种降香黄檀炭疽病均具较强拮抗效果，尤其对降香黄檀炭疽病的抑菌效果显著，抑菌率达77.8%。由于降香黄檀常作为檀香长期寄主二者通常混交，因此选择对二者都具有良好效果的拮抗菌株更有意义。本研究所分离筛选到的甲基营养型芽孢杆菌是在室内条件下对病原菌进行的拮抗实验，但在田间的防效如何尚不得而知，另外对檀香苗木生长有无促进作用，如何开发为生物农药及其使用方法等还需进一步研究。

4 结论

本实验从海南省国营澄迈林场土壤中分离纯化得到71株细菌，筛选出对檀香炭疽病拮抗效果最好的一株，并且通过拮抗菌谱实验初步确定其具广谱性，将该菌株命名为TXJ2-6。综合形态学观察、生理生化特性及16S rDNA序列分析，将TXJ2-6菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）。

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（责任编辑 马鑫）

Isolation，Screening and Identification of Bacteria Antagonistic to Colletotrichum fructicola

Tian Yuanyuan Zhou Guoying Zuo Jie Liu Qianli Yang Quan
（Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-wood Forest Trees of Ministry of Education，Central South University of Forestry and Technology，Changsha410004）

It is aimed to obtain a bacterial strain that has strongly antagonistic activity to Colletotrichum fructicola. Collecting rhizosphere soil from different superior individual of Sandalwood in different parts of Chengmai Forest Farm in Hainan Province and using dilution culture method， 71 strains of bacteria were isolated. Then using C. fructicola as the indicating bacterium， primary screening by flat confrontation and rescreening by fermentation liquid， one strain of bacterium with promising antagonistic activity was obtained， numbered as TXJ2-6. Antibacterial spectrum tests showed it had significantly antagonistic activities to 5 plant pathogens（Colletotrichum gloeosporioides， Agaricodochium camellia， Fusarium proliferatum， Pestalotiopsis microspora， and Colletotrichum gloeosporioides）. Based on the morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA phylogenetic analysis， strain TXJ2-6 was identified as Bacillus methylotrophicus.

Santalum album L.；anthracnose；antagonistic bacteria；screening；identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.022

2014-11-25

国家林业公益性行业科研专项（201304402）

田媛媛，女，硕士研究生，研究方向：森林微生物；E-mail：yuanyuan3356@163.com

周国英，女，教授，研究方向：森林保护与应用微生物；E-mail：gyzhou2118@163.com