高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量

王庆芬，倪晓霞，李杰，张荣

（中国人民解放军第一七五医院·厦门大学附属东南医院制剂科，福建漳州363000）

高效液相色谱法同时测定枇芩口服液中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量

王庆芬，倪晓霞，李杰，张荣

（中国人民解放军第一七五医院·厦门大学附属东南医院制剂科，福建漳州363000）

目的建立同时测定枇芩口服液中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法色谱柱为Kromasil-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脱，流速为1.0mL/min，进样量为10μL，检测波长280 nm，柱温35℃。结果枇芩口服液中的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素达到了完全分离，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的质量浓度线性范围分别为34.20～171.00μg/mL（r=0.999 8），1.44～7.20μg/mL（r=0.999 6），1.36～6.80μg/mL（r=0.997 7）；高、中、低浓度样品的平均回收率，黄芩苷分别为99.09%、99.56%和99.61%，黄芩素为98.46%、97.95%、98.31%，汉黄芩素为98.44%、98.51%和98.10%（n=9）。结论该法操作简单、准确、重复性好，可用于枇芩口服液的质量控制。

枇芩口服液；高效液相色谱法；黄芩苷；黄芩素；汉黄芩素

枇芩口服液是我院皮肤科依据中医辨证理论，结合临床用药经验研制的治疗痤疮的中药复方制剂，由枇杷叶、黄芩、白花蛇舌草等13味中药组方，适用于先天肾阴不足、肾火过旺，加之饮食失节而发病的痤疮患者［1］。处方中黄芩为君药，黄芩活性成分主要为黄酮类化合物，其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素在医药和很多领域有着广泛的用途，试验证明，黄芩对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等抑菌活性好［2］。因此，对黄芩中的主要活性成分进行含量控制，对于该制剂的质量控制具有重要意义。枇芩口服液在我院使用多年，临床效果较好，由于成分复杂，一直以来缺少质量控制方法。现建立了同时测定枇芩口服液中君药黄芩所含黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量的高效液相色谱（HPLC）法［3］，以多指标综合评价其质量，旨在为该制剂的质量控制提供依据。

1　仪器和试药

Agilent 1200 Series型高效液相色谱仪，QUAT Pump G1311A型二极管阵列检测器，ChemState 320型数据处理系统；AUX220型电子分析天平（日本岛津）；一次性针头过滤器；U-S15型实验室超纯水系统。甲醇（HPLC/spectro，TEDIA公司，Lot909910）；磷酸（广东光华化学厂有限公司，批号为20041001）；黄芩苷对照品（批号为110715-201318），黄芩素对照品（批号为111595-200905），汉黄芩素对照品（批号为111514-200403），均由中国药品生物制品检定研究院提供，枇芩口服液（本院制剂室配制，批号为20140509，20140519，20140521）。

2　方法和结果

2.1色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液，梯度洗脱（0～20min，47%甲醇；20～30min，47%～53%甲醇；30～40 min，53%～60%甲醇；40～50 min，60%～53%甲醇；50～55 min，53%～47%甲醇；55～60 min，47%甲醇）；流速：1.0mL/min，柱温：35℃，进样量：10μL，检测波长：280 nm。在上述色谱条件下，分别取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，过滤，分别进样10μL，记录色谱图，结果见图1。结果表明，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素与其他组分均能达到较好的分离，且分离度均大于1.5，理论板数均大于5 000。

图1　枇芩口服液高效液相色谱图

2.2溶液制备

分别精密称取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品17.1，1.2，3.4mg，置50mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为342.00，24.00，68.00μg/mL的对照品贮备液。分别精密吸取黄芩苷对照品贮备液5mL、黄芩素对照品贮备液3mL、汉黄芩素对照品贮备液1mL，分别置25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液。取枇芩口服液适量，用水稀释5倍，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。根据枇芩口服液处方，制备缺黄芩阴性样品，用水稀释5倍，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得阴性对照品溶液。

2.3方法学考察

线性关系考察：精密吸取黄芩苷对照品贮备液5mL、黄芩素对照品贮备液3mL、汉黄芩素对照品贮备液1mL，分别置10，15，20，25，50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，分别依次注入高效液相色谱仪，进样量为10μL，记录峰面积。以对照品溶液质量浓度为横坐标（X）、峰面积值为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。

表1　标准曲线结果

精密度试验：分别精密吸取黄芩苷对照品贮备液5mL、黄芩素对照品贮备液3mL、汉黄芩素对照品贮备液1mL，分别置25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，测定峰面积，连续测定5次。结果黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.07%，0.54%，0.29%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液（批号为20140509），分别在0，3，6，9，12 h时进样，按拟订色谱条件测定峰面积。结果黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.67%，1.18%，1.58%（n=5），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

重复性试验：取样品溶液（批号为20140509）5份，分别依法制备供试品溶液并测定。结果黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素峰面积的RSD分别为1.34%，1.28%，1.17%（n=5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的供试品溶液（批号为20140509，样品含黄芩苷319.1885μg/mL、黄芩素19.8815μg/mL、汉黄芩素9.901 0μg/mL）2 mL，分别加入黄芩苷对照品液（171.00μg/mL）、黄芩素对照品液（6.00μg/mL）和汉黄芩素对照品液（6.80μg/mL）1.0，1.5，2.0mL，用水定容至5mL，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，进样测定。结果见表2。

表2　加样回收试验结果（n=9）

2.4样品含量测定

取3批枇芩口服液，依法制备供试品溶液，测定含量。结果见表3。

3　讨论

进行多种流动相试验，参考2010年版《中国药典（一部）》［4］，以甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）为流动相，因其中磷酸可作为解离抑制剂，抑制组分解离，增强保留［5］，进而采用梯度洗脱的方法［6-9］，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和干扰杂质分离良好，且出峰时间比较早。预试验中曾对比甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）等度洗脱和梯度洗脱，采用等度洗脱方法时，黄芩素出峰时间约在47min，汉黄芩素出峰时间在60min后，分离时间长，分离效果不理想。

表3　样品含量测定结果（μg/mL）

目前，2010年版《中国药典（一部）》及相关文献仅对黄芩中黄芩苷的含量进行控制，单以黄芩苷来衡量黄芩的质量稍显片面性。研究证明，黄芩苷口服液不易吸收，须在肠道经酶水解为苷元黄芩素后方可吸收入血，黄芩素是体内重要有效成分［10］。本试验中建立了同时测定枇芩口服液中3种指标成分的HPLC法，该法科学、合理，能相对较客观、全面地反映枇芩口服液的内在质量，为客观评价其质量提供了科学依据。

［1］蔡元元，陈力.痤疮的中医药辨证治疗［J］.吉林中医药，2013，33（2）：144-145.

［2］张瑜，武斌，许建卫.黄芩药理作用的研究进展［J］.医学综述，2013，19（6）：1 091-1 093.

［3］李堆淑.中药黄芩化学成分的研究进展［J］.江西农业学报，2013，25（8）：51-54.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：282.

［5］韩宪忠，金蜀蓉，柯昌毅.HPLC法测定复方芩苍鼻喷雾剂中黄芩苷的含量［J］.中国药房，2013，24（7）：644-646.

［6］侯学智，张振秋，尤春雪，等.HPLC法测定黄连、黄芩药对提取物中11个成分的含量［J］.药物分析杂志，2013，33（1）：57-62.

［7］张慧，闫磊，林龙飞，等.HPLC法测定小柴胡颗粒中7种指标成分［J］.现代药物与临床，2014，29（2）：162-165.

［8］杭世艳，何兵，张燕.HPLC同时测定银黄颗粒中7种有机酸及4种黄酮类成分［J］.中草药，2013，44（3）：301-304.

［9］周蓬，宋青，马帅.HPLC法同时测定小儿豉翘清热颗粒中栀子苷、芍药苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素［J］.中成药，2013，35（8）：1 693-1 696.

［10］辛文妤，宋俊科，何国荣，等.黄芩素和黄芩苷的药理作用及机制研究进展［J］.中国新药杂志，2013，22（6）：647-659.

Simultaneous Determ ination of Baicalin，Baicalein and Wogonin in Piqin Oral Solution by HPLC

Wang Qingfen，Ni Xiaoxia，Li Jie，Zhang Rong
（Department of Pharmacy，175 Hospital of PLA/the Affiliated Southeast Hospital of Xiamen University，Zhangzhou，Fujian，China 363000）

Objective To establish a method for the simultaneous determination of baicalin,baicalein and bogonin in Piqin Oral Solution by HPLC.M ethods The Kromasil-C18column（250 mm×4.6 mm,5μm）with a column temperature of 35℃was used；the mobile phase consisted of methanol-0.2%phosphate,gradient elution,with flow rate of 1.0 mL/min,and the detection wavelength was set at 280 nm.Results The content of baicalin,baicalein and wogonin achieved a complete separation,peak area of the 3 components had a good linear relationship with the amount of samples.The linear ranges of baicalin,baicalein and wogonin were 34.20-171.00μg/mL（r=0.999 8）,1.44-7.20μg/mL（r=0.999 6）,1.36-6.80μg/mL（r=0.997 7）respectively；the sample-adding recovery were 99.09%,99.56%,99.61%for baicalin，98.46%,97.95%,98.31%for baicalein，and 98.44,98.51,98.10%for wogonin in high，middle，low concentrations（n=9）.Conclusion The method is simple,rapid,accurate and reproducible,and it is suitable for the content determination of baicalin,baicalein and wogonin in Piqin Oral Solution.

Piqin Oral Solution；HPLC；baicalin；baicalein；wogonin

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0093-03

王庆芬，女，主管药师，在读硕士研究生，研究方向为医院制剂，（电子信箱）wqf0596@163.com；张荣，副主任药师，研究方向为药学管理、医院制剂，本文通讯作者，（电话）0596-2975701。

2014-07-28）