蝴堞兰病毒病检测与防治

张清

蝴蝶兰从20世纪80年代之前的珍贵高价兰花蜕变为现今的平价消费性盆花，但台湾业者在20世纪80～90年代由于国际市场需求量远高于台湾本土产能，在买方市场的大环境刺激下，的确有部分业者忽略兰花病毒病管控之重要性。因此当荷兰加入蝴蝶兰产业竞争后，国际上经常有对台湾蝴蝶兰种苗病毒感染比例过高的疑虑，而对台湾蝴蝶兰的外销造成部分冲击。目前多数台湾业者均已引进病毒病控管机制，否则势将遭到淘汰。特别是那些过去几年提早实施病毒病控管的业者，在最近国际经济危机下仍然保有较强的竞争力，更凸显病毒病控管的重要性。本文将针对近几年来台湾产官学界在蝴蝶兰病毒检测与防治上的成果与最新进展加以说明，希望使兰花界朋友能有更清楚的认识与了解。

一、兰花病毒的发现与鉴定

台湾学术界早于1973年及1980年即已分别证实台湾兰花上有蕙兰嵌纹病毒（CymMV）及齿舌兰轮斑病毒（ORSV） 的存在。1988年又发现胡瓜嵌纹病毒（CMV） 可以感染兰花。因此当1990年台湾蝴蝶兰产业开始萌芽时，政府部门的兰花病毒防治策略即已针对三种病毒进行拟定。不过在1990年至2003年间有一种有别于上述三种病毒病征的黄化轮斑症状（vellow ringspotsyndrome）一直出现在台湾各兰园，尤其是白花品系的品种发生比较普遍。当时几个进行兰花病毒研究的实验室，包括台湾研究所与笔者甚至国外包括荷兰在内的病毒学者都一直无法证实此一症状是否为病毒感染所致。由于此种黄化轮斑病症经常出现在台湾外销到各国的种苗上，虽不确定是哪种病毒所感染，国际上仍然将其通称为“台湾病毒Taiwanvirus”，因而对台湾蝴蝶兰外销形象有所影响。所幸到了2003年台湾农改场陈庆忠博士与中兴大学詹富智教授合作，终于证实此病症乃由一种当时国际上刚刚发现鉴定的新病毒所引起。此病毒乃由澳洲学者于番椒上所发现，并且命名为番椒黄化病毒 （Capsicumchlorosisvirus），简称CaCV。由于澳洲学者首先发表与命名，因此遵照国际惯例将此一造成兰花产生黄化轮斑之病毒定名为CaCV。不过荷兰在2008年也正式宣称，在其国内蝴蝶兰上亦发现另二种病毒可以造成与台湾病毒（CaCV）相同的病征，其一为凤仙花坏疽斑点病毒（Impetiens necroticspotvirus，INSV），其二为蕃茄斑点萎凋病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWV）。荷兰并且承认所谓的台湾病毒的称谓并不适当。

2008年中兴大学詹富智教授团队发表在蝴蝶兰上首次发现一种马铃薯Y属病毒感染的病例，该病毒会造成叶片产生黄化斑点病症，因此他们将其暂时命名为Phalaenopsischloroticspotvirus（PhCSV）。不过此一病毒与同时期台湾大学张雅君教授实验室于俗称皇宫菜的洛葵（basella）上所发现的另一种马铃薯Y属病毒（Basellarugosemosaicvirus，BaRMV） 分子特性完全相同。故而二者理论上应该视为同一种病毒而给予同一种命名。由于BaRMV在台湾皇宫菜上发生极为普遍，而蝴蝶兰的PhCSV仅偶然出现在特定地区。因此判断蝴蝶兰上的PhCSV可能是皇宫菜上的BaRMV经由蚜虫传播所致。若以此角度来看，此一病毒称为BaRMV可能较符合实际发生的状况。

截至目前，经过笔者最新确认的全球各地报导可以感染兰花的病毒种类已经高达57种，其中有41种为分类地位明确的病毒，另外16种则属特性有待理清，分类地位仍不明的种类。对于蝴蝶兰而言，目前我们掌握的全球资料中，可能的病毒种类有12种，其中有8种特性清楚分类确定，其余4种则仍有待鉴定。此8种可以感染蝴蝶兰的病毒种类中，真正确认发生于台湾的只有ORSV，CymMv，CaCV，CMV及PhCSV等5种。这五种病毒中经过调查以ORSVGNCymMV分布较为普遍，重要性较高。其次则为CaCV。其他二种事实上因为需经由蚜虫传播，而蝴蝶兰多栽培于温室内，蚜虫发生可能性低，故发生的案例极少，重要性并不高。不过所有可能发生的8种蝴蝶兰病毒台湾方面均已完全掌握检测的技术，并且官方多年来一直委由笔者及其他实验室长期持续监测此等病毒之发生，确保除5种已存在的病毒外不再有入侵之机会。

二、兰花病毒检测技术之开发

台湾早在20世纪90年代初期笔者研究室即已建立CymMV、ORSV及CMV等兰花病毒之抗血清制作与ELISA检定技术，在当时技术水平实际上已经与国际同步。2003年当CaCV被确认为引起蝴蝶兰黄化轮斑的病毒后，因为笔者研究室早已在大岩桐盆花上研究过相同的病毒（HT-1），且已建立检测技术，因此当时即顺利以HT-1的抗血清开始全面应用于CaCV之检测服务。

1995年笔者首度发展出兰花病毒ORSV与Cym-MV之RT-PCR检测技术，将台湾兰花病毒带入核酸检定之层次。到了1999年我们已经成功开发出可以于单步骤下同时检定ORSV及CymMV之RT-PCR技术，也就是所谓的单步聚多目标型（SinglestepmultiplexRT-PCR）。此技术比传统只能侦测单一病毒之RT-PCR技术节省一倍时间、人力及材料成本。此一技术已分别于2006及2007年授权新高及台霖二家兰花种苗公司使用。2008年我们更进一步发展出可同时检测ORSV与CymMV二种病毒之多目标型免疫捕捉RT-PCR技术（Multipleximmune-captureRT-PCR），此技术运用此二病毒之抗体进行RNA的专一捕捉，可以免除兰花样品检测前繁琐的RNA纯化步骤，提升检测效率，适合大量样品之作业。

2006年笔者针对RT-PCR技术在结果判断上的弱点加以改进，发展出所谓的生物品片检测系统，此系统可以同时检测ORSV及CymMV二种病毒。2008年笔者进一步开发出可同时检测ORSV、CymMV及CaDV等三种病毒之单步骤多目标型RT-PCR技术及生物晶片检测系统。此等生物晶片检测系统均已技转晶宇生技公司，进行商业量产及推广，目前约有十家台湾兰花厂商引进此一系统，建立自我检测品管实验室。

2008年初笔者离开农业试验所，转往朝阳科技大学任教，2009年我们甚至已经开发出可以同时检测ORSV及CymMV等五种兰花病毒的生物晶片系统。2010年研究室更进一步建立了目前极受国际科学界瞩目的新技术——即时定量RT-PCR，此一技术改进了先前所有病毒检测技术只能够进行定性判别的限制，可以在2～3小时内完成定量的检测，且由于数据化的结果，在重现性与客观性上都获得相当程度的进行。目前荷兰NAK也开始尝试运用此一技术进行兰花病毒的侦测与鉴定。我们本年度更首度发展出可以同时检测ORSV与CymMV的即时定量RT-PCR技术系统，可以节省一半的检测成本费用，因此台湾在技术开发上已经稍有领先。

三、病毒检测之实际推广与应用

学研界所开发之病毒测技术无非是为了能够提供可行的方法，让兰花业者能够在种苗生产过程中，明确判断出感染或未感染的兰花材料，避免繁殖出感染病毒的种苗。因此这些技术必须能落实应用于兰花产业界，才能真正解决产业界之需求。因此笔者早在20世纪90年代省政府农林厅期间即开始接受委托办理“兰花病毒检定技术研究”计划，将抗血清检定技术无偿转移各试验改良场所及部分中大型兰花种苗业者，协助其建立自我病毒检测实验室。

另外笔者研究室同时也接受业界兰花厂商的委托，进行无偿的检测服务。我们于2003年起开始办理兰花病毒有偿检测服务工作，按件计酬，向委托业者收取规费（其收费标准乃经过财政部之核定，受规费法之限制）。直到笔者2008年初离开农试所为止，五年来累计曾经接受59家不同兰花业者之检测委托，服务样品估计达6万个以上。

2003年至2008年期间我们也曾通过技术授权作业，正式将所开发之病毒检测技术移转私人企业，协助其建立病毒检测实验室，其中包括新高、台霖与晶宇生物技术，目的是希望能使检测技术能广泛应用于兰花产业界，加速兰花病毒植株的淘汰与无病毒种苗之生产。后来晶宇生技甚至将其生物晶片之检测平台商业销售推广于国内厂商应用。目前有台糖等10家业者引进此一系统。

事实上由于台湾多数的兰花生产者、组培厂商与外销业者多属小型厂商，建立自我检测品管实验室，对他们来讲在成本考量上并不经济。若完全仰仗公家研究单位或学校实验室进行检测服务，在效率与服务品质上已尼无法呼应广大业界之需求。因此，2004～2009年间国科会所成立的农业生物技术国家型计划策略决定，将农业分子检测技术产业发展方向着重于检测服务型企业之催生与辅导。此期间曾经接受国科会计划辅导之厂商包括晶宇、睿嘉及宏良甫等，这些厂商后来均成为现今兰花病毒检测服务与试剂的供应厂商，构成目前我国兰花病毒检测服务之基石。2008年笔者辅导艾瑞克生技公司成为另一家独立专责的检测服务公司，进行多种兰花病毒之免疫与分子检测服务。

由于检测服务企业化乃国际间包括荷兰、美国与日本等先进国家运行现况，企业化的运作可以提高服务弹性、效果及品质，而且让企业间自由竞争，本来就是相互砥砺成长的自然法则，依赖公家单位或学研界进行“兼差式”的检测服务，不仅会磨损本应单纯专责于研究工作的技术人员的精力，其效率与弹性亦不敷竞争严苛的产业界之需求。

目前台湾在检测服务的架构上乃由“检测服务企业”、“公家或大学检测服务”、“兰花业者内部自我品管”与“试剂套组制造与供应企业”等来源构成四大基石。依据笔者的观察，四者中目前以私部门所提供之检测服务占有最大的比例。故此等运用测技术之模式与发展上，已经符合国际之趋势，且应用检测技术的普及率与效率上，已经超出任何竞争对手。