红景天提取物对3T3睱1脂肪细胞增殖及细胞分化的影响

李新明 高忠东等

摘要

[目的]应用3T3L1前脂肪細胞株，分析红景天提取物（Rhodiola rosea L. herb extract， RRLHE）对3T3L1细胞增殖和分化的作用。[方法]使用油红O染色法对红景天提取物干预分化的细胞进行评估并定量分析脂肪细胞分化程度。通过逆转录多聚酶联反应（RT-PCR）来检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物体增殖剂活化受体γ（PPARγ）、CAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）mRNA的表达。[结果]红景天提取物能显著抑制3T3L1细胞增殖和向成熟脂肪细胞分化，另外，红景天提取物能显著提高3T3L1前脂肪细胞的葡萄糖摄取和利用率，红景天提取物明显抑制PPARγ、C/EBPα mRNA表达，与对照组比较，差异显著（P<0.01）。[结论]红景天提取物对3T3L1细胞增殖和分化均有抑制作用，并能提高3T3L1前脂肪细胞的葡萄糖摄取和利用率，其影响机制与钝化 PPARγ、C/EBPα mRNA 的表达有关系。

关键词 红景天提取物；3T3L1；细胞分化；PPARγ mRNA

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）05-025-02

Effects of Rhodiola rosea L. Herb Extract on 3T3L1 Proliferation and Differentiation

LI Xinming， GAO Zhongdong， LI Qun et al

（Processing Institute of Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taiyuan， Shanxi 030031）

Abstract [Objective] Preadipocyte 3T3L1 was used to evaluate the effect of Rhodiola rosea L. herb extract （RRLHE） on preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention. [Method] Oil red O staining method was used for evaluation of effect of Rhodiola rosea L. herb extract （RRLHE） on preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention. Adipocyte differentiation related genes expression， peroxisome proliferation activator receptor γ（PPARγ） and CAAT/enhancer binding protein α（C/EBPα） mRNA， were examined by using the reverse transcription polymerase chain reaction （Real time QPCR）. [Result] RRLHE could significantly inhibit preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention toward mature adipocytes. In addition， RRLHE could significantly increase 3H glucose uptake rate in preadipocyte 3T3L1. RRLHE could significantly inhibit PPARγ and C/EBPα mRNA expression compared to control group. [Conclusion] RRLHE can inhibit preadipocyte 3T3L1 proliferation and differention toward mature adipocytes， enhance 3H glucose uptake rate in preadipocyte 3T3L1. The inhibitory effect has a relationship to deactivation of PPARγ and C/EBPα mRNA genes expression.

Key words Rhodiola rosea L. herb extract； 3T3L1； Cell differentiation； PPARγ mRNA

作者简介

李新明（1970-），男，陕西西安人，副研究员，从事食品科学研究。

收稿日期 20141229

红景天是景天科（Crassulaceae）红景天属（Rhodiola L.）多年生草本或亚灌木植物。红景天中含有多种化学成分，主要有黄酮类、酪醇、红景天苷、谷甾醇、有机酸、挥发油、多糖、脂肪、蛋白质等，具有增强免疫功能，保护心脑血管等功效[1-2]。

笔者从与脂肪细胞分化密切相关的2个因子过氧化物体增殖剂活化受体γ（peroxisome proliferator activated receptor PPARγ）和CAAT/增强子结合蛋白α（CAAT/enhancer binding protein C/EBPα）入手，观察了红景天提取物对其mRNA表达的影响，为深入探讨红景天提取物改善脂代谢的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

红景天提取物为山西省农业科学院制备。

3T3L1前脂肪细胞株购自American Type Culture Collection （ATCC）。其他试剂为Amresco公司产品或购自Sigma公司。

1.2 3T3L1前脂肪细胞的增殖及检测

前脂肪细胞（3T3L1）分为对照组（不加药）和药物处理组。不同浓度前脂肪细胞（3T3L1）接种在96孔板上，参照XTT法描述，测定吸光度值（A570），建立细胞数目曲线。然后再将1.5×104/ml浓度的前脂肪细胞3T3L1接种于96孔板，每孔为100 μl培养基，在细胞贴壁后，加变化浓度的RRLHE（100、150、200 μg/ml）进行干预培养，分别检测各组细胞的A570值，通过“A570值细胞数目”曲线计算每加药24、48和72 h的细胞数目。

1.3 红景天提取物对前脂肪细胞3T3L1葡萄糖摄取率的影响

3T3L1前脂肪细胞经培养和诱导分化为成熟的脂肪细胞后。将成熟的脂肪细胞以含0.2%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM培养基培养12 h后，分为4组：对照组（不加RRLHE）、低中高（100、150、200 μg/ml）剂量RRLHE处理组，药物处理培养24 h。按文献[3]所述方法测定3H葡萄糖摄取率。

1.4 3T3L1前脂肪细胞的培养、诱导分化和定量检测

将3T3L1前脂肪细胞按文献[4]所述方法进行诱导分化，诱导分化8～12 d的3T3L1细胞85%以上呈脂肪细胞表型。

设置空白对照组（normal control，CON组）、红景天提取物干预组[RRLHE组（100、150、200 μg/ml）]及罗格列酮干预组（ROS组），在培养液中分别加入不同浓度的干预药物。罗格列酮为10 μmol/L，CON组加等体积生理盐水。分化液与药同时加入，同步更换药物与培养液。分化第8天开始油红O染色，拍摄照片。异丙醇处理已染色的细胞，在细胞裂解后通过酶标仪对脂滴着色程度进行比色，检测OD值（570 nm波长），定量分析细胞的分化程度。

1.5 实时定量PCR检测PPARα和C/EBPα基因在3T3L1细胞中的表达

引物设计：PPARγ上游5′TTTCAAGGGTGCCAGTTT3′，下游5′AGGCCAGCATCGTGTAG3′，C/EBPα上游5′GGAAAGAAACGACTGGGAGC3′，下游5′CGACTAGACGCTATTGTGATT3′，GAPDH上游5′ATGAGGTCCACCACCCTG3′，下游5′TTGACCTCAACTACATGG3′；使用Trizol試剂从细胞中提取总RNA，通过寡脱氧核苷酸和MMLV逆转录酶合成cDNA，采用Tag DNA多聚酶PCR反应扩增cDNA产物，应用ABIPRISM 7000序列检测系统测定mRNA拷贝和循环数的线型关系，设定标准曲线。将正常对照组mRNA的表达量设为1，计算各组mRNA的相对表达量。

1.6 数据处理

采用SPSS12.0软件进行数据分析，结果用（x±SD） 表示，并进行组间差异比较，当P<0.05时表明差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 红景天提取物对前脂肪细胞3T3L1增殖的影响

在空白对照组，3T3L1前脂肪细胞数量在24、48、72 h呈倍数增长；与空白对照组比较，100、150、200 μg/ml RRLHE作用后（24、48、72 h），明显抑制了脂肪细胞的增值，且有一定的剂量依赖关系（5.29±0.17、4.72±0.09、4.48±0.11 vs 5.35±0.12； 8.05±0.13、7.66±0.12、6.84±0.15 vs 8.79±0.07； 15.73±0.43、15.47±0.31、15.04±0.29 vs 16.05±0.34），即RRLHE浓度越高则抑制作用越明显，与对照组比较差异有统计学意义（表1，P<0.05，P<0.01）。

油红O脂肪特异性染色结果发现，相比较对照组，RRLHE处理组细胞内亮红色的脂滴显著减少，充脂细胞数和细胞体积也随之降低，相比较对照组，罗格列酮处理组OD值也显著增加，罗格列酮组分化成典型的成熟脂肪细胞形态，细胞圆而大，胞内充满了脂滴。意味着高浓度RRLHE可显著降低脂肪细胞内脂肪的生成量，对3T3L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化具有显著的抑制作用。

2.2 红景天提取物对前脂肪细胞3T3L1 3H葡萄糖提取率的影响

红景天提取物对前脂肪细胞3T3L1 3H葡萄糖摄取率的影响见图1，与对照组相比较（Con组葡萄糖摄取率当作参考对照基值（100%），其他药物处理组分别与CK组相比较当作各组的葡萄糖摄取率。），RRLHE处理组细胞内3H葡萄糖摄取率随药物剂量的增加而显著增加（108.8±2.6、117.6±4.1、122.1±3.5 vs 100±2.2），显示出明显的剂量依靠效应。

注：*P<0.05，**P<0.01。

2.3 红景天提取物对前脂肪细胞3T3L1中PRARγ和C/EBPα mRNA表达的影响

RRLHE对脂肪细胞PPARγ和C/EBPα mRNA表达的影响见表2，RRLHE组PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA表达量显著低于对照组（0.85±0.03 vs 1.00±0.1； 0.83±0.04 vs 1.00±0.1），与对照组相比，罗格列酮组的PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA表达量显著增加（2.51±0.09 vs 1.00±0.1； 2.44±0.11 vs 1.00±0.1）（表2，P<0.01）。

3 讨论

红景天具有许多生物活性，如改善血液微循环、活血化瘀和缓解高原缺氧、促进体脂和胆固醇代谢，减轻高脂血症的作用。大量动物试验已经证明了红景天提取物降低动物高脂血症的效果[5]。红景天提取物在临床上广泛应用于高脂血症的治疗[6]。在目前的试验中，红景天提取物能够降低3T3L1前脂肪细胞增殖和向成熟脂肪细胞分化，结果从细胞水平证明了红景天提取物能够调节脂代谢紊乱。另外，红景天提取物处理能够显著增加前脂肪细胞3T3L1内3H葡萄糖摄取率，这一效果随药物剂量的增加而增加，表明红景天提取物在一定程度上能够减轻胰岛素抵抗效应。这表明红景天提取物可以提高葡萄糖摄取和利用，但不会增加体脂的聚积，从而不会引起体重的过度增加。

作为脂类代谢的重要调节因子，PPAR在调控能量代谢方面起重要作用，能够调解脂肪酸吸收、脂肪沉积和形成、脂类代谢内环境和胰岛素抵抗[7]。在脂肪组织、小肠上皮细胞、骨骼肌和淋巴等多种器官及组织中，PPARγ广泛表达[7]。C/EBPα属于亮氨酸拉链转录因子家族，可诱导成纤维细胞中的脂肪形成。活化的C/EBPα单独能增加自身的表达，同时还能够与PPARγ协同诱导细胞分化[8]。该研究表明，红景天提取物能够抑制3T3L1前脂肪细胞中PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA的表达，这与罗格列酮的作用相反，推测红景天提取物作为 PPAR 的配体，激活和活化了 PPAR 受体，提高了肝脏PPARγ mRNA、PPARα mRNA 的表达，进而启动了下游与脂质代谢有关酶的一系列基因转录，加速了脂肪氧化

分解，从而改善了脂质代谢紊乱，这可能是红景天提取物改

善脂质代谢紊乱的作用机理之一。

推测红景天提取物通过降低 PPARγ、C/EBPα mRNA 的表达来抑制脂肪细胞的分化，进而抑制脂质在脂肪细胞内的积聚和前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，增加葡萄糖的摄取和利用、抑制体脂的积聚，最终延缓体重的增加，从而其脂类和糖类代谢的改善作用。

参考文献

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[6] EUN JU SHIN，HAENG JEON HUR，MI JEONG SUNG，et al.Ethanol extract of the Prunus mume fruits stimulates glucose uptake by regulating PPARγ in C2C12 myotubes and ameliorates glucose intolerance and fat accumulation in mice fed a highfat diet [J]. Food Chemistry，2013，141（4）： 4115-4121.

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安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（5）：140-141

责任编辑 乔利利 责任校对 李岩