农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的优化

陈 磊 郭政宏等

摘要

[目的] 探讨魔芋愈伤组织培養基、不同转化条件（菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间）及转化植株的筛选条件（抗生素浓度和乙酰丁香酮（AS）浓度）等因素对转化效率的影响。[方法]采用卡那霉素抗性基因为选择标记，对农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系进行优化。[结果]在预培养2 d，用OD600为0.6的菌液侵染30 min、共培养3 d，卡那霉素100 mg/L，羧苄青霉素250 mg/L，AS浓度100 μmol/L的条件下能有效提高转化效率。再生花魔芋植株经GUS染色及PCR检测，结果表明外源目的基因已经整合到花魔芋基因组中。[结论] 为魔芋抗病品种的转基因培育，丰富其种质资源，寻找抗病新途径提供理论依据和试验基础。

关键词 花魔芋；农杆菌；遗传转化体系

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）05-021-04

Optimized Genetic Transformation System of Amorphophallus konjac Mediated by Agrobacterium tumfaciens

CHEN Lei， GUO Zhenghong， CHENG Haili， YUE Chaoyin*

（Biotechnology Research Center， Three Gorges University， Yichang， Hubei 443002）

Abstract [Objective] Factors that influence Agrobacterium tumfaciensmediated transformation of Amorphophallus konjac， including culture medium， transformation conditions and selection reagents were investigated. [Method]An transformation system mediated by Agrobacterium tumfaciens has been optimized to obtain transgenic plants of Amorphophallus konjac by using kanamycin resistance gene as marker gene. [Result]The results showed that preculture for 2 days before infection by Agrobacterium （OD600= 0.6， 30 min） and then coculture for 3 days yielded the highest rate of antibiotic resistant callus formation with the addition of kanamycin （100 mg/L）， carbenicillin （250 mg/L） and acetosyringone（100 μmol/L）. The transgenic plants were screened and reclarified by GUS staining and PCR analysis that the exogenous gene was integrated into Amorphophallus konjac genome.[Conclusion] The study provided theoretical basis and experimental basis for cultivating genetically resistant varieties， riching germplasm resources and finding new ways for disease resistance.

Key words Amorphophallus konjac；Agrobacterium tumfaciens；Genetic transformation system

基金项目 国家自然科学基金项目（30871579）。

作者简介

陈磊（1990-），男，湖北孝感人，硕士研究生，研究方向：微生物与植物互作。*通讯作者，教授，博士，从事微生物与植物互作研究。

收稿日期 20141222

魔芋（Amorphophallus）属天南星科（Areaceae）魔芋属多年生草本植物，其变态茎宿存于地下，通常呈球形、扁球形或柱状球形[1]，主要栽培种为花魔芋Amorphophallus konjac）和白魔芋（Amorphophallus albus）。魔芋块茎内富含葡甘聚糖（Konjac glucomannan）、各种人体必需氨基酸和微量元素[2]。葡甘聚糖可广泛用于食品、医药、保健、农业、化工、纺织、石油钻探等领域，具有极大的商业价值。

随着魔芋种植面积的不断扩大，魔芋软腐病的发生也逐年加剧，发生严重时产量损失达30%～50%，严重的达80%以上，甚至绝收[3]，严重影响农民种植魔芋积极性。魔芋软腐病是由胡萝卜软腐欧氏杆菌软腐病亚种（Erwinia carotovora Var. cartovora）侵染所致[4]，该病有2个明显的特征，即组织腐烂和有恶臭味，不仅在魔芋田间生长阶段发病，造成叶片、叶柄及块茎软腐，还可在魔芋贮藏期间发病造成块茎腐烂。

自1983年人类首次获得转基因植物以来，植物遗传转化技术发展十分迅速，该项技术目前已成为植物性状遗传改良的重要手段。2000年新加坡国立大学Dong等[5]从芽胞杆菌Bacillus 240B1中克隆到抗软腐病aiiA基因，将该基因转入烟草、马铃薯后，获得的转基因植株具有较好的软腐病抗性。但魔芋的遗传转化研究起步较晚，到目前为止，国外未发现这方面的报道，国内仅有几例抗软腐病遗传转化的相关报道。张兴国等[6]采用RT-PCR方法从白魔芋组培苗的幼嫩球茎组织中克隆到ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因。周盈等[7]初步建立了农杆菌介导花魔芋遗传转化体系，但并未进行转化条件的优化及后续感病试验来验证转基因魔芋的抗软腐病能力。