小鼠NF—κBp65亚基真核表达质粒的构建

杨雪梅　吴靖萱　屈玮

摘要 [目的] 构建小鼠NFκB p65亚基真核表达质粒。 [方法] 扩增NFκB p65亚基，然后构建其真核表达质粒（mNFκBp65pEGFPC1），并通过PCR和测序验证重组质粒中p65亚基的正确性；然后提取无内毒素的质粒，转染HepG2细胞，通过观测重组蛋白所融合的绿色荧光蛋白，检测目的蛋白表达情况。[结果] PCR产物的电泳结果显示，成功扩增了小鼠NFκB p65亚基，成功构建了小鼠NFκB p65亚基的真核表达质粒，将其命名为mNFκBp65pEGFPC1。在真核细胞中，重组质粒可以成功表达小鼠NFκB p65亚基融合绿色荧光蛋白的目的蛋白。[结论] 重组质粒NFκBp65pEGFP构建成功，为后续开展NFκB信号通路的相关研究奠定了基础。

关键词 NFκB；p65；重组质粒；真核表达

中图分类号 S865.1+3；Q786 文献标识码 A 文章编号 05176611（2015）20-038-03

Abstract [Objective] To construct mice NFKB p65 subunit eukaryotic expression plasmid. [Method] The NFκB p65 subunit was amplified by PCR， and then digested and ligated to pEGFPC1. The recombined plasmid was termed mNFκBp65pEGFPC1， and validated by enzyme digestion and PCR. Finally， we purified the endotoxinfree plasmid DNA， and transfected it into the HepG2 cells. The expression of NFκB p65 subunit was assayed by observing the fusion GFP protein. [Results] The electrophoresis results indicate that we have successfully obtained the NFκB p65subunit gene， and constructed the mice NFκB p65 subunit eukaryotic expression plasmid. After transfection into HepG2 cells， the recombined protein expressed successfully. [Conclusion] The mice NFκB p65 subunit eukaryotic expression plasmid was constructed successfully， which is important for the further study of NFκB signal in macrophage.

Key words NFκB； p65； Recombinant plasmid； Eukaryotic expression

肥胖正在全球范圍迅速蔓延，肥胖增加了个体罹患心血管疾病、糖尿病、骨关节炎和某些癌症的风险，严重威胁着人类健康[1-3]。肥胖过程中，脂肪组织增大所导致的免疫细胞浸润、炎性因子分泌增加，以及游离脂肪酸增多，引起了低度的慢性炎症，这一慢性炎性是引起肥胖相关代谢疾病的重要原因[4]。NFκB信号通路在调控炎性及压力应答中起了核心作用，外界病原菌侵入或内部压力会在大多数细胞中激活NFκB信号通路，此外NFκB信号还与癌症的发生相关[5]。最近的研究表明，NFκB信号通路与胰岛素抵抗的形成密切相关[6-8]。在哺乳动物中，NFκB转录因子家族包含5个蛋白：p65（RelA）、RelB、cRel、p105/p50 （NFκB1）以及p100/p52 （NFκB2），这些蛋白具有保守的RHD结构域，可以形成同源或异源复合物调控转录。p50/65异源二聚体是最主要的Rel二聚体，在NFκB信号通路中扮演了重要角色[9-11]。

为了进一步研究NFκB调控巨噬细胞影响脂肪组织炎性中的作用，笔者拟构建小鼠NFκB p65亚基的真核表达质粒。小鼠的p65基因mRNA全长1 740 bp，其编码区长度为1 650 bp，共编码549个氨基酸。构建的小鼠p65真核表达质粒，为后续探究其对于NFκB p65亚基的调控，及其调控脂肪组织炎性的相关机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

RNA提取试剂TRIzol和反转录酶Reverse Transcriptase MMLVG购自Invitrogen公司， 限制性内切酶、DNA连接试剂盒和Taq酶购自TaKaRa公司；pEGFPC1质粒和HepG由合肥工业大学肥胖与代谢疾病研究所保藏；DNA纯化试剂盒购自Axygen公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自上海生工公司；胎牛血清（FBS）、optiMEM和DMEM培养基购自Gibco公司；Lipofecta mine 2000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠NFκB p65亚基引物设计。

通过NCBI找到GenBank中NFκB p65亚基序列，序列编号为GI：M61909.1。根据其mRNA中的编码区进行引物设计，引入限制性内切酶酶切位点（加粗处），引物序列如下：上游引物为5 CCCTCGAGATGGACGATCTGTTTCCCCT 3（引入XhoⅠ酶切位点）；

下游引物为5 CCCAAGCTTTTAGGAGCTGATCTGACTC 3 （引入HindⅢ酶切位点）。引物由Invitrogen公司（上海）合成。

1.2.2 小鼠NFκB p65亚基扩增。

取小鼠肝脏，剪碎后利用TRIzol提取总RNA，验证RNA完整性及纯度后，再利用反转录酶MMLV反转录合成cDNA。 以cDNA为模板，利用设计的上下游引物扩增小鼠NFκB p65亚基的ORF序列。反应体系为50 μl： rTaq酶0.25 μl，10× PCR Buffer 5 μl，dNTP 4 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA模板1 μl，灭菌水37.75 μl。PCR循环条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共3个循环；94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共27个循环；最后72 ℃延伸5 min。利用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。

1.2.3 小鼠NFκB p65亚基真核表达重组质粒的构建。

将上述PCR产物（包含NFκB p65亚基的开放读码框）和pEGFPC1载体，使用XhoⅠ和HindⅢ双酶切，电泳后再利用DNA纯化试剂盒纯化DNA。然后用DNA连接试剂盒连接NFκB p65亚基和pEGFPC1载体，构建重组质粒。连接产物转化感受态JM109，挑取菌落，PCR验证确认重组菌包含p65亚基后，LB液体培养基扩大培养。使用无内毒素质粒抽提试剂盒提取重组质粒，将重组质粒命名为mNFκBp65pEGFPC1，-80 ℃储存备用。

1.2.4 HepG2细胞的培养和瞬时转染。HepG2细胞在37 ℃、5% CO2的条件下培养，培养基为含10%FBS的DMEM，隔天更换1次培养基，细胞长满后用胰酶进行消化传代。转染试验时，将细胞接到96孔细胞培养板上培养，细胞密度达到90%融合时，准备转染试验，首先用不含血清和双抗的DMEM处理过夜；然后每孔按以下方法转染，分别准备50 μl optiDMEM加入0.5 μg mNFκBp65pEGFPC1重组质粒，50 μl optiMEM 加入1 μl Lipofecta mine 2000脂质体，静置5 min后，将两者充分混匀后细胞上转染6 h；然后去除转染液，加入无血清无双抗DMEM，恢复培养过夜； 利用倒置熒光显微镜观察绿色荧光，拍照。

2 结果与分析

2.1 小鼠NFκB p65亚基扩增

取小鼠肝脏，提取总RNA，取1 μg 总RNA反转录得到cDNA，然后利用PCR扩增小鼠NFκB p65亚基开放读码框。琼脂糖凝胶电泳结果表明，成功扩增了小鼠NFκB p65亚基，包含引入的酶切位点全长1 664 bp（图1）。

2.2 小鼠NFκB p65亚基真核表达重组质粒的构建

将上述扩增的小鼠NFκB p65亚基（通过引物引入了酶切位点）（图1），以及pEGFPC1质粒经XhoⅠ和HindⅢ双酶切（图2），纯化后用DNA连接试剂盒进行连接。连接后转化到大肠杆菌JM109进行扩增，提取重组质粒，用PCR验证重组菌是否包含了目的基因（图3）。PCR验证结果表明重组菌中包含了

NFκB p65亚基的开放读码框，然后送去测序，测序显示重组质粒中的插入序列与NFκB p65的ORF完全一致，说明NFκB p65亚基的真核表达质粒构建成功，将其命名为mNFκBp65pEGFPC1。扩大培养后，提取不含内毒素的重组质粒。

2.3 重组质粒mNFκBp65pEGFPC1的真核转染验证

为了验证构建的重组质粒mNFκBp65pEGFPC1能否在真核细胞中进行表达，将重组质粒转染进入HepG2细胞，通过观察绿色荧光，来判断NFκBp65蛋白的表达情况。将不含内毒素的质粒利用Lipofecta mine 2000脂质体转染NFκBp65后，分别在24和48 h后观察绿色荧光（图4）。结果表明转染48 h后有很强的绿色荧光，说明重组质粒在真核细胞中成功表达了NFκBp65的融合蛋白。

3 讨论

肥胖的流行及其相关代谢疾病，严重危害着人类健康。肥胖作为一种低等的慢性炎性疾病理论，已经得到广泛共识，也为肥胖的预防与控制提供了新的思路[4-5，12]。作为炎性调控的核心信号通路，NFκB信号通路参与了肥胖的发生及其相关代谢疾病的产生[6-8]。NFκB转录因子家族由众多蛋白组成，其中p65亚基及其与p50组成的异源二聚体是细胞中含量最丰富的NFκB转录因子。因此，研究NFκB信号通路在脂肪组织炎性中的作用，并筛选以p65等NFκB转录因子为靶标的天然产物或药物，有助于肥胖机理的阐明和新的治疗方式的开发。这就需要建立相关的体外筛选体系，那首要目标就是建立p65的真核表达质粒，该研究恰是围绕这一目标展开。

P65在肝脏中表达丰度较高，笔者利用小鼠的肝脏提取RNA，反转录得到cDNA，然后成功扩增小鼠p65的编码区（图1）。将PCR产物经XhoⅠ和HindⅢ双酶切后（图2）与真核表达质粒pEGFPC1连接，PCR验证（图3）表明，成功构建了重组质粒，将其命名为mNFκBp65pEGFPC1。提取无内毒素的质粒转染HepG2细胞，观察到绿色荧光（图4），说明融合蛋白得到了成功表达。成功构建的小鼠p65真核表达质粒，可以用于真核表达试验，为后续研究NFκB信号通路在脂肪组织炎性中的作用，筛选以p65为靶标最终调控脂肪组织炎性及相关代谢疾病的天然产物或药物奠定了基础。

参考文献

[1]JAMES P T， LEACH R， KALAMARA E，et al. The worldwide obesity epidemic [J]. Obes Res， 2001， 9（suppl4）： 228-233.

[2] LEVINE J A. Obesity in China： Causes and solutions [J]. Chin Med J， 2007， 120（11）： 1043-1050.