低温胁迫下桂蕉6号幼苗叶片差异蛋白表达研究

庞昇泽　孙洁　禤维言等

摘要 [目的]研究低温胁迫下桂蕉6号幼苗叶片差异蛋白的表达。[方法]分别用TCA/丙酮法和酚抽提法提取桂蕉6号幼苗叶片总蛋白；用2DE电泳分析低温胁迫处理和常温下桂蕉6号叶片差异蛋白的表达。[结果]酚抽提法提取的总蛋白垂直电泳效果更好；从2DE图谱中获得了一些具明显差异表达的蛋白点16个，其中表达上调的8个，表达下调的7个，低温处理幼苗叶片特有蛋白1个；成功鉴定9个。[结论]酚抽提法更适合提取香蕉叶片总蛋白。

关键词 桂蕉6号；低温胁迫；双向电泳；差异蛋白

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-032-03

Abstract [Objective] To research differences in protein expression of Guijiao No.6 seedling leaves. [Method] TCA/acetone method and phenol extraction method were both used to extract the total protein of Guijiao No.6 seedling leaves.2DE electrophoresis was used to analyze differences in protein expression of Guijiao No.6 seedling leaves under low temperature stress. [Result] The effect of vertical electrophoresis of protein extracted by phenol extraction method was the better one.Some significantly differentially expressed protein spots were discovered on 2DE maps. 16 obviously differential expressed protein spots were discovered， including 8 spots up， 7 spots down and 1 unique spot for the seedling leaves under low temperature stress in differential protein electrophoresis of 2DE. 9 spots were successfully identified. [Conclusion] Phenol extraction method was more suitable to extract the total protein of banana leaves.

Key words Guijiao No.6； Low temperature stress； Twodimensional electrophoresis； Differences in protein

香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉属（Musa）植物，原产于亚洲东南部，包括中国东南地区、马来西亚、新几内亚和菲律宾。香蕉是世界上产量最大的三大水果之一，也是许多发展中国家除水稻、小麦、玉米之外的重要粮食作物[1]。香蕉是热带水果，对温度条件的要求较高，喜高温多湿，怕低温，忌霜寒，最适宜温度为24～32 ℃，15 ℃以下就会发生低温冷害[2]。低温会抑制香蕉发育，降低其生长速率，更为严重的低温会使香蕉遭受不可逆的危害，从而极大地影响香蕉生产，导致减产低产。2008年1月中旬至2月中旬，广西受到建国以来最强的一次平流型低温阴雨灾害天气影响，给香蕉等热带水果造成严重寒害[3]。

植物在环境胁迫下的机理一直是研究热点之一，近年来，关于水稻、小麦、甘蓝等植物的低温胁迫研究取得了相当大的进展，包括生理生化特征、低温胁迫蛋白以及响应低温胁迫的蛋白及基因表达调控等方面的研究[4-6]。而关于香蕉在低温胁迫下的生理学、栽培学和气象学方面的研究使香蕉的防寒技术得到了广泛应用，但其低温胁迫下分子生物学机制目前仍不清楚[7-9]。运用蛋白双向电泳技术获得差异表达蛋白，通过生物信息学，对低温胁迫过程中的某些特异表达蛋白进行系统研究成为近年来解析香蕉低温胁迫下的分子生物学机制的重要突破口[10]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验品种为广西大面积种植的桂蕉6号（购自广西农业科学院生物技术研究所），选取株高30 cm左右、七叶一心、长势均匀、无病虫害的幼苗为试验材料。

1.2 材料处理

将选取的香蕉幼苗置于温室培养15 d后，移16盆到光照培养箱（白天光照强度为7 500 lx，晚上为0 lx，光照时间12 h/d）中，将温度控制在7 ℃，其他培养条件不变。于12、24、48、96 h后分别取样，取样时剪取倒三叶迅速与液氮保存，取样完毕后放入-80 ℃保存备用。其中，0 h作为对照。

1.3 香蕉叶片总蛋白质的提取

1.3.1

TCA/丙酮法。采用改良的TCA/丙酮法[11]。

1.3.2

酚抽提法。参照Carpentier等[12]的方法。

1.4 蛋白质的裂解与定量

裂解液成分为7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS和1%DTT。

采用Bradford法對提取的蛋白进行定量。

1.5 垂直SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白

分离胶浓度为12.5%，浓缩胶浓度为5%，每个泳道蛋白上样量为30 μg；开始电流恒定在10 mA，当进入分离胶后改为20 mA；电泳后胶块染色[（0.2%（W/V）考马斯亮蓝G250，40%（V/V）甲醇，10% （V/V）冰乙酸）]1 h；染色后的胶块用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液[（5%（V/V）甲醇，7.5%（V/V）冰乙酸）]脱色至背景清晰。

1.6 双向凝胶电泳分离蛋白

第一向等电聚焦（IEF）的胶条24 cm，pH为4～7，上样量为450 ug。第二向SDSPAGE凝胶浓度为12.5%，在垂直电泳槽中进行电泳，用银染法染色。

1.7 图像分析

用Umax描仪扫描，Image Master 2D Platinum软件分析2DE凝胶图像。

1.8 质谱鉴定

采用串联质谱技术，包括酶解、点靶、质谱鉴定和数据库搜索等。

2 结果与分析

2.1 2种不同蛋白提取方法的SDSPAGE结果对比

2种不同蛋白质提取方法所提取的香蕉幼苗叶片蛋白的垂直SDSPAGE电泳结果见图1。由图1可知，2种方法提取的蛋白经SDSPAGE分离后条带数目无明显差异，但染色深浅差异明显，酚抽提法所得到的蛋白染色更深，也更清晰。

2.2 2DPAGE分离蛋白结果

选择可比性较好的电泳图谱，调整未经过低温处理和经过低温处理的桂蕉6号幼苗叶片蛋白2DE图谱的背景，修改和检测图谱上的点。用ImageMaster 2D platinum软件分析时发现，经过低温处理的幼苗叶片蛋白2DE图谱与未经过低温处理的幼苗叶片蛋白2DE图谱相比，出现一些差异蛋白点。差异点蛋白图谱见图2。

由图2可知，以未经低温处理的为参考胶，分析发现经过低温处理的幼苗叶片和未经过低温处理的幼苗叶片存在显著表达差异的蛋白点16个，其中表达上调的8个（6、7、8、9、13、14、15、16），表达下调的7个（1、2、3、4、10、11、12），经过低温处理的幼苗叶片特有的1个（5）。这16个蛋白点在图谱中表现稳定，易于从凝胶上挖取下来用作下一步质谱鉴定。

2.3 质谱结果

对有明显表达差异的16个蛋白质点进行质谱鉴定，所有的测定样品都得到了完整的肽质量指纹图谱（PMF）。其中9个蛋白点（1、2、3、4、5、6、7、8、9）通过胶内酶解，质谱鉴定和数据库检索结果见表1。

2.4 差异蛋白序列相似性比对

在NCBI中通过蛋白gi號获得氨基酸序列，然后根据氨基酸序列在Uniprot蛋白数据库中通过序列对比，搜索出与之序列相似性最高的蛋白，并获得蛋白的相关序列ID，结果见表2。

3 讨论

样品制备是双向电泳技术成功的关键，蛋白质的提取方法有很多种[13]，但没有一种方法普遍适用于所有物种，因为每种提取方法都有各自的特点。如TCA/丙酮法作为一种传统的蛋白提取方法，具有操作简便、减少蛋白降解等特点，但提取后的蛋白不易复溶导致蛋白提取率低，是SDSPAGE条带浅的重要原因；而酚抽提法也会由于操作步骤中较易损失蛋白，导致后续双向电泳得到的蛋白点相对较少。因此，最适合提取蛋白的方法，因物种、组织以及目标蛋白的不同而各异。韦玉梅等[14]研究表明，酚/SDS法适合烟草叶片蛋白的提取；王卓等[15]研究表明，酚抽提法适合香蕉果实蛋白的提取；梁书剑等[16]研究表明Mg/NP40法更适合分离分子量为14～20 kD或大于67 kD等电点在5～7的蛋白质，TCA法更适合分离分子量在31～67 kD等电点在4～5的蛋白质。该试验通过对2种提取方法提取桂蕉6号幼苗叶片蛋白垂直电泳效果的对比可见，用酚抽提法提取香蕉幼苗叶片组织蛋白整体效果更好，说明提取香蕉叶片总蛋白用酚抽提法更合适，这与祁君凤等[10]的研究结果一致。

串联质谱技术能够在短时间内从蛋白混合物中鉴定出其组分，目前分析串联质谱数据使用最多的是基于数据库搜索的鉴定算法，如Mascot等[17]。质谱鉴定不成功的原因可能与香蕉蛋白数据库不完善有关，尽管在试验中得到质谱数据，但往往得不到理想的鉴定结果；也可能与凝胶上蛋白点的大小、位置等不适合作质谱鉴定有关[11]。

香蕉果实与香蕉品质直接相关，其低温胁迫下的响应机制已涉及差异蛋白与核酸信息的综合研究[18]。该试验以属香芽蕉的桂蕉6号幼苗叶片为研究对象，获得的差异蛋白点少于祁凤君[10]以巴西蕉幼苗叶片为材料获得的28个，鉴定结果有属相同家族的蛋白（差异点1、4、6），无相同蛋白。这可能与试验材料的低温敏感性不同有关；也可能与建立的双向电泳体系不同有关。该研究获得的差异蛋白点少于周萍[11]以水稻冷敏感品系9 311为材料研究获得的28个，鉴定结果无属相同家族的蛋白，也无相同蛋白，且该研究成功鉴定的蛋白分子量最大值和等电点最大值都明显更大，数值范围也更广，说明低温胁迫下香蕉幼苗叶片差异表达蛋白点在图谱上更分散。

该试

验鉴定出的表达上调或下调的蛋白点可以运用蛋白印迹检测进行确认，得到的差异表达蛋白序列相似性比对结果，可以通过Quickgo获取相关蛋白的氨基酸序列、大概参加的通路、分子功能等信息，综合起来推测差异蛋白的相关功能，为揭示香蕉抵御低温的机制和品种的培育提供更多的依据和支持。

4 结论

（1）用酚抽提法来提取香蕉叶片总蛋白比TCA/丙酮沉淀法更合适。

（2）采用24 cm，pH 4～7，450 μg上样量双向电泳体系，从图谱中分析得到有明显差异表达蛋白点16个，其中表达上调的8个，表达下调的7个，经过低温处理的幼苗叶片特有的1个。

（3）成功鉴定9个差异表达蛋白点。

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