HPLC测定银线草中酚酸的含量

袁琴琴

摘要[目的]采用HPLC方法测定不同部位不同采收季节银线草中酚酸类含量。[方法]采用高效液相色谱法，色谱柱为Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.1%甲酸线性梯度洗脱，流速为0.8 ml/min；检测波长323 nm，柱温25 ℃。[结果]银线草中迷迭香酸、反丁烯二酸、绿原酸在测定范围内线性关系较好（r≥0.999 1），平均回收率为97.5%～105.1%；不同部位不同采收季节银线草酚酸类含量存在一定差异。[结论]该方法操作简便、定量准确、重现性好，可用于银线草中酚酸类含量的测定。

关键词银线草；HPLC；酚酸；含量测定

中图分类号S567.23+9文献标识码

A文章编号0517-6611（2015）31-074-03

Determination of the Phenolic Acids Content in Chloranthus japonicus Sieb. by HPLC

YUAN Qinqin1，2

（1.Department of Life Science， Heze University， Heze，Shandong 274000；2.Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry of Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drug in Northwest of China， Shaanxi Normal University， Xian，Shaanxi 710062）

Abstract [Objective]Determination of different parts and seasons of phenolic acids content in Chloranthus japonicus Sieb. by HPLC.[Methods]The chromatographic separations were obtained by the Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）with the gradient elution solvent system composed of methanol and 0.1%formicacid，the flow rate was 0.8 ml/min， the wavelength was set at 323 nm and the column temperature was maintained at 25 ℃.[Results]The linear ranges of fumaric acid， chlorogenic acid and rosmarinic acid were better （r>0.999 1）， the average recovery between 97.5%-105.1%.There was a certain difference of different parts and seasons of phenolic acids content in Chloranthus japonicus Sieb..[Conclusion]The method was simple， accurate quantitative and good reproducibility，which can be used for the determination of phenolic acids content in Chloranthus japonicus Sieb..

Key words Chloranthus japonicus Sieb.；HPLC；Phenolic acids； Content determination

銀线草（Chloranthus japonicus Sieb.）是金粟兰科（Chloranthaceae）金粟兰属（Chloranthus Swartz）多年生的草本植物，以全草或根入药，主要治瘀血肿痛、毒蛇咬伤、疖疮肿毒等，一直作为民间中草药被广泛的使用。银线草的化学成分复杂，主要含有倍半萜类、酚类、香豆素类、酰胺类、木脂素类、甾体及甾体皂苷类等[1-4]。银线草中的酚酸类物质是其主要活性成分之一，现代药理学研究表明，酚类成分具有良好的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗激素、抗血栓、抗变态反应等活性[5-6]。由于它们特殊的生理作用，研究酚类化合物具有十分重要的意义。该试验采用HPLC法测定了银线草不同采收季节不同部位的迷迭香酸、反丁烯二酸、绿原酸的含量，以期为银线草资源的合理开发利用提供基础研究数据，也为进一步对银线草的活性成分研究奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试材。银线草于2011年4～7月底采集于陕西省太白山，经陕西师范大学生命科学院田先华教授鉴定为金粟兰科金粟兰属植物银线草（Chloranthus japonicus Sieb.）。

1.1.2试剂。甲醇（美国Fisher公司，色谱纯）；甲酸（天津市天力化学试剂有限公司，分析纯）；所用水均为超纯水；迷迭香酸（批号07902PH），反丁烯二酸（批号11154-200001），绿原酸（批号110753200413），均来源于中国药品生物制品检定所。

1.1.3仪器。LC2010 AHT HPLC（日本SHIMADZU岛津公司），SL202N 型电子秤（上海民桥精密科学仪器有限公司），MILLI-Q 超纯水仪器（MILLIPORE公司），RE250AA 旋转蒸发仪器（上海亚荣生化仪器公司），KQ5200超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司），色谱柱Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5μm，美国Phenomenex公司），SL202N 型电子秤（上海民桥精密科学仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1样品溶液的制备。银线草不同采收期的根、茎、叶粉碎后过60目筛，各精密称取1 g，置于20 ml带塞锥形瓶中，2次加入5 ml甲醇，超声30 min，提取2次，经0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。

1.2.2标准品溶液的制备。适量称取反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸标准品，溶于甲醇，分别配成1.0、0.5和0.502 mg/ml的溶液，溶液须经0.22 μm滤膜过滤后备用。

1.2.3色谱条件。色谱柱为Phenomenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温25 ℃；流速0.8 ml/min；检测波长323 nm，进样量10 μl。低压梯度洗脱条件分别为0～5 min，甲醇15%～25%；5～20 min，甲醇25%～30%；20～45 min，甲醇30%～40%；45～95 min，甲醇40%～60%。

1.2.4方法学考察。

1.2.4.1线性关系考察。精密吸取反丁烯二酸溶液1.0、3.0、5.0、8.0、12.0、16.0、25.0 μl，绿原酸1.0、3.0、5.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μl，迷迭香酸1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、13.0、16.0 μl，在“1.2.3”项色谱条件下进样，分别以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并计算其回归方程。

1.2.4.2精密度試验。取按“1.2.2”方法制备的3种标准品溶液分别进样5次，计算反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸峰面积的RSD值。

1.2.4.3重现性试验。精密秤银线草样品，按“1.2.1”项进行样品提取，按“1.2.3”色谱条件，连续进样5次，计算反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸的RSD值。

1.2.4.4稳定性试验。精密秤银线草样品，按照“1.2.1”项制备溶液，分别于0、4、8、16、24、48 h进样，测定峰面积，计算RSD值。

1.2.4.5加样回收试验。精密称取银线草样品2 g，每份分别加反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸对照品2 mg，按照“1.2.3”色谱条件进样，测定峰面积，按外标法计算反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸含量，计算样品回收率和RSD，结果取5次平均值。

1.2.5样品的含量测定。按“1.2.2”方法分别取不同月份不同部位的银线草，按“1.2.4.1”方法对其反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸的含量进行测定。

2结果与分析

2.1标品和银线草样品的HPLC色谱图 按照“1.2.2”、“1.2.1”溶液制备方法和“1.2.3”色谱条件得到标品和样品HPLC色谱图（图1～2），由标品图谱和供试品溶液的图谱可知，标品和样品中的反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸出峰保留时间一致，样品所测定的反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸峰旁边无明显杂峰。

2.2方法学考察

2.2.1线性关系考察。按“1.2.4.1”方法操作，反丁烯二酸、绿原酸、迷迭香酸的线性回归方程分别为Y=8.03×104X+3.47×104、Y=106X+4.86×105、Y=106X+2.65×105，其相关系数分别为0.999 4、0.999 7、0.999 1，表明反丁烯二酸、绿原酸、迷迭香酸分别在1.0～25.0、0.5～10.0、0.502～8.302 μg的范围内呈良好的线性关系（表1）。

2.2.2精密度试验。按“1.2.4.2”方法操作，计算得出反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸峰面积的RSD分别为1.6%、1.2%和2.4%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3重现性试验。按“1.2.4.3”方法操作，计算得反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸的RSD值分别为1.5%、1.9%和17%，表明该方法重现性较好。

2.2.4稳定性试验。按“1.2.4.4”方法操作，计算得出反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸的RSD值分别为2.3%、2.8%和1.6%，表明样品溶液在48 h内基本上稳定。

2.2.5加样回收试验。按“1.2.4.5”方法操作，测得银线草中反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸的加样回收率（n=5）为97.5%～105.1%，RSD（n=5）分别为2.4%、1.9%、2.1%。

2.3银线草不同采收季节、不同部位酚酸成分的含量测定方法确定并验证后，取不同月份不同部位的银线草对其反丁烯二酸、绿原酸和迷迭香酸的含量进行测定，从图3可以看出，不同部位不同采收季节银线草中酚酸的含量存在一定差异。反丁烯二酸主要存在于茎和叶中，且在4、5月份含量高于6、7月份；绿原酸主要存在于叶子中，且4、5、6月份叶里的含量远高于根和茎中，在4月份含量最高；迷迭香酸主要存在于叶子中，5、6、7月份叶里的含量远高于茎和根，在5月份含量最高。

安徽农业科学2015年

3讨论

在波长为323 nm时，同时检测反丁烯二酸、绿原酸、迷迭香酸3种成分，酚类化合物常带有酚羟基，故在水中会发生部分解离，在洗脱时不会依次被洗脱，不能形成独立的峰，所以在使用高效液相色谱进行分离时，需在流动相中加入少量的酸以抑制它的解离，以达到能够进行科学分析的效果[7]。该试验采用甲醇-0.1%甲酸水为HPLC分离银线草酚类流动相体系，且采用了梯度洗脱的分离模式。

《中国药典》（2010）规定的金粟兰科草珊瑚属肿节风药材另一考察指标是迷迭香酸，而该试验得出银线草中迷迭香酸的含量高于《中国药典》（2010）规定的0.02%[8]，可以为银线草的质量控制提供参考。

中药材不同部位的化学成分含量相差比较大的现象普遍存在，这与化学成分在生物体中的合成部位和积累有一定的关系，因此在进行化学成分研究时应给予一定的重视。银线草的地上和地下部分有效成分含量差异很大，而酚酸类物质主要存在于叶和茎中，尤其在叶里含量远高于根，表明银线草不同部位的生理活性可能会有所侧重，在临床应用时应加以区别。

参考文献

[1]周浙昆.金粟兰科的起源、演化及其分布[J].云南植物研究，1993，15（4）： 321-331.

[2] 陈海山，程用谦.金粟兰科的起源分化和地理分布研究[J].热带亚热带植物学报， 1994，2（4）： 31-38.

[3] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第九卷第一分册[M].北京：科学出版社，1982： 79-80.

[4] 张玲，初洪波，赫玉芳，等.银线草研究进展[J].黑龙江医药，2010，25（2）： 170-172.

[5] 吴建章，郁建平，赵东亮.迷迭香酸的研究进展[J].天然产物研究与开发，2005，17（3）：383-388.

[6] 罗奇志，戴开金，马安德.肿节风化学成分的高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析[J].中药材，2009，32（4）：526-529.

[7] 谢越，俞浩，汪建飞.高效液相色谱法同时测定滁菊样品中的9种酚酸[J].分析化学，2013，32（4）：383-388.

[8] 国家药典委员会.中国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.