水稻LRR型受体蛋白激酶OsRPK1胞外区酵母双杂交诱饵载体构建

朱晓南

摘要[目的]寻找水稻LRR型蛋白受体激酶（Leucine rich repeat receptor protein kinase）OsRPK1胞外结构域的互作蛋白。 [方法]以日本晴水稻为研究材料，以水稻根部cDNA为模板通过PCR扩增方法得到OsRPK1胞外结构域基因编码片段OsRPK1-OD（969 bp）。将该片段插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7，构建重组诱饵载体pGBKT7OsRPK1OD。[结果]对pGBKT7-OsRPK1OD进行毒性检测和转录自激活鉴定，酵母生长结果发现，含有pGBKT7OsRPK1OD载体的 Y2H Gold细胞，在SD/Trp、SD/Trp/Xαgal营养缺陷型固体培养基上生长出白色菌落，在SD/Trp/Xαgal/AbA固体培养基上生长受到抑制；在SD/Trp生长出含有pGBKT7OsRPK1OD载体的 Y2H Gold酵母菌落大小与转化了空载的酵母菌落大小一致，显示插入的OsRPK1OD对酵母生长无毒性作用。[结论]OsRPK1OD无法参与激活转录酵母中报告基因HIS3，ADE2，MEL1和AUR1C，该片段可以作为诱饵基因筛查水稻cDNA文库，寻找与之相互作用的蛋白质。

关键词水稻受体激酶；OsRPK；酵母双杂交；诱饵载体

中图分类号S188文献标识码

A文章编号0517-6611（2015）31-045-02

Construction on Leucine Rich Repeat Receptor Protein Kinase OsRPK1 Extracelluar Domainss Coding Gene as Yeast Two Hybrid Bait Vector of Oryza sativa L.

ZHU Xiaonan

（Jiangnan University Bioengineering academy，Wuxi， Jiangsu 214122）

Abstract[Objective] The aim was to construct leucine rich repeat receptor protein kinase OsRPK1 extracelluar domainss coding gene as yeast two hybrid bait vector of Oryza sativa L.[Method] Using Oryza sativa L. as research material， OsRPK1OD， extracelluar domainss coding gene of a leucine rich repeat receptor protein kinase OsRPK1 was amplified by PCR with rice roots cDNA as template （969 bp）.The fragment was inserted into bait vector pGBKT7 which was used for yeast two hybrid to construct recombinant bait vector pGBKT7OsRPK1OD sucessfully. pGBKT7OsRPK1OD was transformed into Y2H Gold competence cells to do toxic test and autoactivition identification. [Result]The results of strain Y2H Gold showed Y2H Gold cells containing pGBKT7OsRPK1OD could grow up to the white colonies on SD/Trp， SD/Trp/Xαgal plates， and grown inhibited on SD/Trp/Xαgal/AbA plates. The colonies of Y2H Gold containing pGBKT7OsRPK1OD showed the same size with the colonies of Y2H Gold containing pGBKT7， which meant the inserted OsRPK1OD had no toxic effect on yeast growing. [Conclusion] OsRPK1OD couldnt activate the transcription of report genes HIS3，ADE2，MEL1 and AUR1C in yeast two hybrid system. It would make the OsRPK1OD become the bait gene to screen the rice cDNA library and find the interaction protein.

Key words Rice receptor protein kinase； OsRPK；Yeast two hybrid； Bait vector

植物LRR型受體蛋白激酶是数目最庞大的激酶家族之一[1]，广泛参与植物生长发育、响应外界环境变化等途径。植物中对拟南芥油菜素甾醇类（brassinosteroid，BR）信号通路研究较为全面。BR是拟南芥产生的一类特殊活性成分[2]，对植物的多种生理功能产生作用，主要影响茎的伸长、花粉管生长、木质部分化和叶片卷曲等，且在多种植物中对其功能进行了验证[3]。拟南芥BRI1是第一个分离出的BR受体[4]，其含有25个LRR结构域；BR另一受体BAK1[5]仅含有5个LRR结构域，同属于LRRRLK家族[6]；此外，植物BIN2蛋白表达量在BR存在时表现降低。当植物受到BR诱导刺激时， BRI1与BAK1在细胞膜上形成BRI1BAK1异源二聚体[7-9]，抑制BIN2表达，核内相关酶类去磷酸化并大量积累从而调控BR相关基因的表达[10]。

OsRPK1基因在植物水稻组织中特异性表达，且表达量受生长素、NaCl、干旱等条件因素的诱导影响[3]。SMART在线预测OsRPK1蛋白含有4个结构域：信号肽区、4个连续的串联的LRR结构域、跨膜结构域、S_TKc蛋白激酶结构域，即典型的LRR型受体蛋白激酶家族蛋白结构，LRR型胞外受体结构域一般被认为是信号结合中心，开启信号传递和级联放大[3]。OsRPK1的CDS全長2 910 bp，编码LRR区域的核苷酸为1 605 bp。目前研究表明，OsRPK1基因可能与生长素和高盐胁迫调控通路有关[11]。为寻找水稻LRR型蛋白受体激酶OsRPK1胞外结构域的互作蛋白，笔者以日本晴水稻为材料，构建水稻LRR型受体蛋白激酶OsRPK1胞外区酵母双杂交诱饵载体。

1材料与方法

1.1材料酵母Y2H Gold菌株、pBGKT7质粒（购自美国Clontech公司），野生型日本晴水稻由南京农业大学生命科学学院保存；SD/Trp、Xαgal、Aureobasidin A （AbA）购自美国Clontech公司；DNA限制性内切酶Sma I、Bam H I购自宝生物工程（大连）公司；T4连接酶购自宝生物工程（大连）公司；PrimerStar聚合酶购自宝生物工程（大连）公司。

1.2方法

1.2.1OsRPK1OD的PCR扩增和诱饵载体构建。

根据OsRPK1OD的基因序列信息，设计上游引物S1：5′TCCCCCCGGGGACGCTGCGGCGCTCG3′和下游引物S2：5′CGGGGATCCTCCAGCTATGGCACCTGTGCTCATC3′，以野生型日本晴水稻根部cDNA为模板进行PCR扩增。用DNA限制性内切酶Sma I、BamH I分别双酶切OsRPK1OD扩增产物和pGBKT7载体，将OsRPK1OD片段和pGBKT7载体的酶切产物进行连接反应，转化大肠杆菌DH5α感受态，最终双酶切、测序验证成功构建重组诱饵载体pGBKT7OsRPK1OD。

1.2.2酵母Y2H Gold菌株感受态制备和重组诱饵载体的转化[12]。酵母Y2H Gold菌株感受态制备方法、载体转化酵母方法均参照Clontech公司手册《Yeast Protocols Handbooks》。

1.2.3pGBKT7OsRPK1OD自激活活性检测[12]。

转化10 ng诱饵载体至Y2H Gold。转化的Y2H Gold细胞悬浮液分别按1/10、1/100 比例稀释，取100 μl稀释液涂布于SD/Trp、SD/Trp/XαGal琼脂平板（100 mm）上，30 ℃培养4 d至菌落出现为止。

1.2.4pGBKT7OsRPK1OD毒性检测[12]。

分别转化10 ng诱饵载体、pGBKT7至Y2H Gold感受态细胞。转化的Y2H Gold细胞悬浮液分别按1/10、1/100 比例稀释，取100 μl稀释液涂布于SD/Trp平板（100 mm）上，30 ℃培养4 d至菌落出现为止。比较转化重组诱饵载体和空载的酵母菌落大小。若该诱饵载体含有毒性，则在相同生长时间内，菌落与同期转化了pGKBT7的菌落比较明显较小。

2结果与分析

2.1pGBKT7OsRPK1OD载体构建

根据OsRPK1基因序列信息设计S1、S2引物扩增OsRPK1OD片段。对PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。由图1A可知，扩增得到PCR产物条带大小为1 000 bp左右，与预期结果相符。将该PCR产物回收用限制性内切酶Sma I、BamH I双酶切，与已双酶切的pGBKT7过夜连接，最终获得重组诱饵载体pGBKT7OsRPK1OD，并进行了双酶切验证（图1B）。

2.2pGBKT7OsRPK1OD自激活活性检测

由于载体pGBKT7自身带有GAL4转录复合物中合成DNAbinding结构域的编码基因，因此，需要检测插入了外源基因的重组诱饵载体表达出的融合蛋白产物对酵母双杂交系统的报告基因是否具有自激活作用，为后续筛库试验排除自激活产生假阳性的可能。pGBKT7载体上还携带Trp的营养合成基因，因而转化了重组诱饵载体pGBKT7OsRPK1OD的Y2H Gold菌株可以在SD/Trp培养基上生长。若重组诱饵载体表现出报告基因MEL1、AUR1C的自激活活性，即酵母生产过程中可分解底物XαGal，菌落呈现青蓝色，则该基因不能够用酵母双杂系统研究其蛋白之间的相互作用。

从图2可以看出，转化了pGBKT7OsRPK1OD的Y2H Gold在SD/Trp/XαGal培养基上均表现为白色菌落（图2B）。说明OsRPK1OD对报告基因MEL1、AUR1C没有激活作用。

2.3pGBKT7OsRPK1OD毒性检测

在进行筛库试验之前需要对重组诱饵载体进行毒性检测，防止诱饵载体的表达产物融合蛋白BDOsRPK1OD对酵母Y2H Gold存在毒性作用，若是融合蛋白对酵母生长表现出毒性作用，则会导致后期筛库过程中，酵母生长状态较差，菌体浓度和酵母合子均无法达到筛库最低标准，此时需要考虑更换诱饵载体。

将载体pGBKT7OsRPK1OD和pGBKT7分别转化酵母菌株Y2H Gold，以1/10比例稀释后涂布SD/Trp琼脂培养基，30 ℃下恒温培养3～4 d出现单菌落。毒性检测结果见图3，与转化空载的酵母（左侧）相比，转化pGBKT7OsRPK1OD的酵母生长状态良好（右侧），未表现出菌落直径过小或者转化效率较低。表明融合蛋白DNA BDOsRPK1OD对酵母Y2H Gold生长无毒性作用。

注：左侧.转化pGBKT7OsRPK1OD的Y2H Gold菌株在SD/Trp平板上的生长情况；右侧.转化pGBKT7的Y2H Gold菌株在SD/Trp平板上的生长情况。

图3pGBKT7OsRPK1OD对Y2H Gold菌株生长毒性检测

3结论

酵母双杂交系统利用酵母表达系统和GAL4基因转录启动系统，解决了基因表达量过低而无法检测出较弱蛋白相互作用。因此，酵母双杂交是研究蛋白质组学一个方便、快捷而有效的试验技术手段[12]。OsRPK1是水稻中新发现的LRR型受体激酶，且该蛋白表达受到盐环境、植物激素等因素影响。OsRPK1在水稻根部特异表达，影响水稻生长过程中营养物质吸收和根系组织发育；寻找OsRPK1的胞外配体，发现OsRPK1上游事件有助于阐明该信号通路机制。

由于SMART在线预测OsRPK1蛋白含有4个结构域：信号肽区、4个串联的LRR结构域、跨膜结构域、S_TKc蛋白激酶结构域，OsRPK1蛋白通过跨膜结构域将蛋白锚定于细胞膜上，为了寻找与OsRPK1蛋白胞外结构域相作用的配体，该研究构建了pGBKT7OsRPK1OD诱饵载体，转化酵母Y2H Gold菌株后，经自激活检测和毒性检测，结果发现DNA BDOsRPK1OD融合蛋白无法激活HIS3、ADE2、MEL1、AUR1C等报告基因；同时，GAL4 BDOsRPK1OD融合蛋白对酵母Y2H Gold生长无毒性作用，生长状态良好。综上可知，pGBKT7OsRPK1OD诱饵载体构建成功，且转化pGBKT7OsRPK1OD诱饵载体的酵母生长状态良好，该载体对酵母双杂交系统报告基因无激活作用，可以用于水稻cDNA文库的筛选以寻找OsRPK1OD的互作蛋白。

参考文献

[1] SHIU S H，BLEECKER A B.Receptor-like kinases from Arabidopsis form a monophyletic gene family related to animal receptor kinases[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（19）：10763-10768.

[2] NAKAMURA A，FUJIOKA S，SUNOHARA H，et al.The role of OsBRI1 and its homologous genes，OsBRL1 and OsBRL3，in rice[J].Plant physiology，2006，140（2）：580-590.

[3] 汪清.水稻OsRPK1激酶域的表达纯化及体外激酶活性验证[D].南京：南京农业大学，2011.

[4] LI J，WEN J，LEASE K A，et al.BAK1，an Arabidopsis LRR receptorlike protein kinase，interacts with BRI1 and modulates barssinosteroid signaling[J].Cell，2002，110（2）：213-222.

[5] NAM K H，LI J M.BRI1/BAK1，a receptor kinase pair mediating barssinosteroid signaling[J].Cell，2002，110（2）：203-212.

[6] GAO J，MA Y Y，SUN Y，et al.Crystallization and preliminary crystallographic analysis of Arabidopsis thaliana BRI1associated kinase 1 （BAK1） cytoplasmic domain.[J].Structural biology and crystallization communications，2012，68（3）：340-342.

[7] RUSSINOVA E，BORST J W，KWAAITAAL M，et al.Heterodimerization and endocytosis of Arabidopsis brassinosteroid receptors BRI1 and AtSERK3 （BAK1）[J].Plant cell，2004，16（12）：3216-3229.

[8] WANG X，LI X，MEISENHEL DER J，et al.Autoregulation and homodimerization are involved in the activation of the plant steroid receptor BRI1[J].Dev Cell，2005，8（6）：855-865.

[9] HINK M A，SHAH K，RUSSINOVA E，et al.Fluorescence fluctuation analysis of Arabidopsis thaliana somatic embryogenesis receptorlike kinase and brassinosteroid insensitive 1 receptor oligomerization[J].Biophys J，2008，94（3）：1052-1062.

[10] KIM T W，GUAN S，SUN Y，et al.Brassinosteroid signal transduction from cell surface receptor kinases to nuclear transcription factors[J].Nat Cell Biol，2009，11（10）：1254-1260.

[11] ZOU Y，LIU X，WANG Q，et al.OsRPK1，a novel leucinerich repeat receptorlike kinase，negatively regulates polar auxin transport and root development in rice.[J].Biochim biophys acta，2014，1840（6）：1676-1685.

[12] 朱曉南.利用酵母双杂交筛选拟南芥细胞色素f相互作用蛋白[D].南京：南京农业大学，2014.