雷州黑鸭PID1基因部分序列的克隆与蛋白功能分析

黄汉光 汤绮明 苏瑛 许冲 崔红艳 常羽 黄骏腾

摘要 [目的]了解雷州黑鸭磷酸酪氨酸互作结构域1（phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID 1）基因的序列结构特征及其蛋白的功能，为利用其改善雷州黑鸭肉品质与提高肉风味提供分子理论依据。[方法]采用RTPCR方法克隆雷州黑鸭PID1基因部分序列，测序后比对其同源性，构建系统发育树，并预测其蛋白结构与功能。[结果]该核苷酸序列长度为369 bp，编码80个氨基酸，且大多为疏水性氨基酸。与人、牛、鸡等物种进行同源性比对，发现雷州黑鸭PID1基因序列与鸡具有高度同源性，同源性高达94%，且雷州黑鸭与鸡聚于同一系统发育支。蛋白质结构预测表明，该蛋白无跨膜结构与信号肽，氨基酸序列呈疏水性，位于细胞质中。[结论]雷州黑鸭的PID1基因与鸡的亲缘关系最近，其蛋白主要功能是在细胞质中参与肌内脂肪沉积的调控。

关键词 雷州黑鸭；PID1；克隆；蛋白功能分析

中图分类号 S834+.89 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）34-207-04

肌内脂肪（IMF）是衡量鸭肉品质的重要指标之一，与肉的口感嫩度、咀嚼性能及多汁性等密切相关[1]，适量的肌内脂肪不仅改善肉的风味，也提高了消费者的感官满意度。肌外膜、肌内膜及肌束膜是肌内脂肪的主要储存场所。研究表明，一方面，肌内脂肪主要通过溶解肌纤维束的作用来提高肉品质的多汁性与口感嫩度，另一方面，磷脂是肌内脂肪的主要组成成分，占20%～50%，磷脂通过增加脂肪酸的降解产物，进而提高肉香味相关化合物的含量，从而改善肉的香味[1-2]。磷酸酪氨酸互作结构域 1（Phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID1）是利用抑制性消减杂交技术从正常人群与肥胖人群腹部脂肪组织中检测到的差异性表达基因，提交 NCBI 后，根据该基因的结构特征被国际统一命名为PID1基因[1，3]。脂肪沉积能力是衡量动物经济价值的重要参数之一，对脂肪沉积相关候选基因进行研究，可为畜禽品种选育提供参考依据，进而加速育种进程。研究表明，PID1基因通过促进更多的3T3L1脂肪前体细胞进入染色质合成期，进而发挥促进脂肪细胞增殖的作用[3-4]。此外，PID1基因的过表达对胰岛素受体底物1（insulin receptor sustrate family 1，IRS1）的酪氨酸磷酸化进程具有抑制作用，降低机体对胰岛素的敏感性，进而影响脂肪代谢[5]。钱源等[6]对莱芜猪PID1基因CDS区进行克隆、表达，并对该基因进行功能性分析，结果表明，PID1基因与莱芜猪的肌内脂肪沉积有关。殷捷等[7]采用RTPCR方法测定了PID1基因在安徽白山羊不同组织的表达情况，并分析PID1基因与白山羊肌内脂肪的相关性，结果表明PID1基因与安徽白山羊的肌内脂肪沉积量显著相关。目前人类、大鼠、牛、猪、鸡的PID1基因的CDS 序列已经被克隆，但鸭PID1基因序列的克隆与蛋白功能分析未见报道，此外，鸭肌内脂肪沉积的主效基因尚未确定[8]。笔者根据 GenBank登录的鸡PID1基因序列并参考文献设计引物，扩增出长度为 369bp雷州黑鸭的PID1基因CDS序列，并對其蛋白结构进行功能性分析，为研究雷州黑鸭肌内脂肪代谢调控机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

300 d雷州黑鸭种公鸭1只，颈静脉放血，取胸肌，置于液氮中进行速冻，-80 ℃保存备用。

1.2 试剂与设备

DEPC、RNAiso Regent、Master Mix（2x）、Gel Extraction Kit、pUCT simple vector、OneLysePlasmid Mini Kit均购自北京康为世纪生物科技有限公司；PrimeScriptⅡ1st strand cDNA synthesis Kit购自宝生物工程（大连）有限公司；LB固体培养基、LB液体培养基、缓冲液1×TSS、50 μg/ml Amp/LB固体培养基、50 μg/ml Amp/LB液体培养基均按照要求配制。

1.3 试验方法

1.3.1 引物的设计与合成。

根据GenBank登录的鸡PID1基因序列（登录号为NM_001178144.1）分别设计出两对引物并标记为P1、P2（表1），引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

表1 引物序列

引物上游（5′3′）下游（5′3′）

P1GCAGCACTTTCAGACCATATTTCCAGAAGAGCATTAGC

P2ACGCTTGCCAGGGAGGATATGTGGTCAGCAGTGCAGTAGG

1.3.2 cDNA片段的制备。

取胸肌50 mg，添加液氮进行研磨后，用Trizol提取总RNA。用Eppendorf BioPhotometer plus检测其浓度和纯度。然后使用PrimeScriptⅡ1st strand cDNA synthesis Kit试剂盒，参见试剂盒说明书合成cDNA。

1.3.3 目的片断的扩增。

扩增体系（50 μl）：cDNA溶液2.0 μl，上游引物（10 μmol/L）2.0 μl，下游引物（10 μmol/L）2.0 μl，Master Mix（2x）25 μl，dH2O 19 μl。扩增参数：预变性94 ℃ 2 min；变性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min 10 s（30个循环）；延伸72 ℃ 2 min；25 ℃保存产物。

1.3.4

产物回收与测序。采用1%的琼脂糖凝胶对产物进行电泳，后用Gel Extraction Kit试剂盒对目的片段进行回收，-20 ℃保存备用。

用pUCT simple与回收的目的片段连接，产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性重组子，摇菌，用OneLysePlasmid Mimi Kit试剂盒抽取质粒，送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。

1.3.5 序列分析与蛋白质结构、功能预测。

所得序列经测序后用NCBI进行比对，证明所得序列为雷州黑鸭PID1基因CDS区，后将该序列翻译成蛋白质，利用NCBI和DNAMAN的BLAST分析软件分析所获得的核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性并构建系统进化树。使用ExPASy服务的各种在线软件对该蛋白质序列的结构与功能进行预测。

2 结果与分析

2.1 雷州黑鸭PID1基因的序列分析

测序结果显示，所得雷州黑鸭PID1基因核苷酸序列长度为367 bp，与预期相同。该核苷酸序列与鸡PID1基因（NM_001178144.1）54～422 bp区段具有较高相似度，于574～953 bp处有一个完整的开放阅读框，具有分析意义。该片段碱基G、C、A、T分别占23.4%、26.4%、26.4%、23.7%，四者所占比例相近，A+T的含量（50.1%）略高于C+G的含量（49.8%）。该序列共编码80个氨基酸。

2.2 雷州黑鸭PID1基因的序列同源性比较及系统发育进化分析

用BLAST在线软件对雷州黑鸭与其余物种的PID1基因进行同源性分析，结果显示同类型物种具有较高同源性，雷州黑鸭与鸡的PID1基因同源性高达94%。基于Kimura双参数遗传模型，利用MEGA 4.1软件构建PID1基因系统发育树。人、大猩猩、绵羊、牦牛、牛、猪、鼠、褐家鼠聚在一支，雷州黑鸭与鸡聚于同一支，而斑马鱼则单独成一支（图1）。

2.3 雷州黑鸭PID1基因的蛋白质结构与功能预测

2.3.1 疏水性分析。

使用ExPASy的ProtScale程序Kyte[9]和Doolittle构建疏水性图谱并计算蛋白质疏水性GRAVY值。结果显示，氨基酸序列的两端呈亲水性，疏水氨基酸比例较高，且亲水性氨基酸与疏水性氨基酸交替出现（图2）。

2.3.2 跨膜结构分析。用TMPRED软件预测分析雷州黑鸭PID1蛋白分子的跨膜结构。TMPRED分析结果显示PID1不存在跨膜蛋白结构（图3）。

2.3.3 信号肽的预测。

采用ExPASy Proteomics Server中的SignalP 4.0 Serverprediction软件分析表明，PID1蛋白序列不存在蛋白质信号肽（图4）。

2.3.4 蛋白质二级结构的预测。用HNN软件预测雷州黑鸭PID1蛋白的二级结构，结果显示存在随机卷曲、延伸结构和alpha螺旋3种二级结构（图5），延伸结构、alpha螺旋及随机卷曲分别占30.0%、11.25%及58.75%。

3 讨论

3.1 雷州黑鸭PID1部分碱基序列分析

研究结果显示，PID1基因核苷酸序列因物种不同而存在差异性，亲缘度高的物种，核苷酸序列相似度越高。BLAST对比分析发现，人、大猩猩、绵羊、牦牛、牛、猪、鼠、褐家鼠聚在一支；雷州黑鸭与鸡聚于同一支，且同源性高达94%[9-10]；而斑马鱼则单独成一支。这表明，PID1基因在同物种间具有种属相似性和生物多样性，同时不同物种间具有差异性。相近的序列与蛋白结构，其发挥的功能往往相类似[11]。骨骼肌特异性钙蛋白酶（Muscle specific calpain，p94）被广泛应用于研究肉的嫩度[12-13]。雷州黑鸭与鸡p94基因同源性达90%以

上，且两者所表达蛋白质结构非常相近，推测雷州黑鸭p94蛋白同样参与肌肉嫩度的调节功能[11]。研究表明，PID1与动物肌内脂肪沉积密切相关[7，14]。推测由于雷州黑鸭与鸡PID1基因同源性高，且雷州黑鸭PID1基因存在一定的自身特异性，是导致雷州黑鸭肉质鲜香，肌肉嫩，良好风味，成为广受欢迎的肉产品[15-16]的根本原因。

3.2 雷州黑鸭PID1氨基酸序列疏水性分析

利用雷州黑鸭PID1基因氨基酸序列构建的疏水性图谱，可以看出雷州黑鸭PID1基因氨基酸序列中疏水性氨基酸比例较高，且均匀分布于整个肽链中。钱源等[2，6]对莱芜猪PID1基因进行克隆、表达并研究其与肌肉内脂肪沉积关系，结果显示猪PID1氨基酸序列整体表现为亲水性。疏水性氨基酸可稳定蛋白质的内部构象，而亲水性则增加了蛋白质的溶解性。因此，雷州黑鸭PID1基因编码的疏水性蛋白质比猪的PID1蛋白结构更稳定。

43卷34期 黄汉光等 雷州黑鸭PID1基因部分序列的克隆与蛋白功能分析

3.3 雷州黑鸭PID1蛋白的结构比较与功能分析

SignalP 4.0 Server-prediction软件分析表明，雷州黑鸭PID1蛋白序列不存在蛋白质信号肽。TMPRED软件预测分析雷州黑鸭PID1蛋白分子的跨膜结构，结果表明，PID1不存在跨膜蛋白结构。推测雷州黑鸭PID1前体蛋白于胞质合成后，前体蛋白直接在胞质内加工成成熟蛋白质，进而发挥其生物学功能。这和钱源等[6]在豬PID1基因CDS区的克隆、表达及其mRNA表达与肌内脂肪沉积关系的研究中的研究结果猪的PID1蛋白为细胞质蛋白是一致的。

蛋白质二级结构预测结果显示，随机卷曲占雷州黑鸭PID1蛋白结构的58.75%。而钱源等[2，6]研究结果表明，猪PID1蛋白质结构以alpha螺旋为主。这可能与动物进化过程中对生存环境及养殖模式的适应性演变有关。

雷州黑鸭的PID1基因与鸡的亲缘关系最近，其蛋白主要功能是在细胞质中参与肌内脂肪沉积的调控。

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