虫草发酵菌粉的活性成分分析

许春燕 李恒 陆震鸣

摘要 [目的]比较虫草头孢和蝙蝠蛾被孢霉2种发酵菌粉中活性组分的差异，为虫草发酵菌种的开发提供数据参考。[方法]采用重量法测定多糖含量，采用离子色谱法检测粗多糖的单糖组成，采用高效液相色谱法测定核苷类物质含量，采用FolinCiocalteu法测定总多酚含量，采用香草醛-高氯酸法测定总三萜含量。[结果]2种菌粉中粗多糖含量在7%左右，均由6种单糖构成；发酵菌粉中均检测到含量较高的胞苷、鸟苷和腺苷等核苷类化合物；2种虫草发酵菌粉中总多酚的含量约5 mg/g，三萜物质含量约8 mg/g。[结论]虫草头孢和蝙蝠蛾被孢霉2种发酵菌粉在多糖、核苷、多酚和三萜类物质的含量上无显著差异，均具有较高的药用活性和良好的开发前景。

关键词 虫草；虫草头孢；蝙蝠蛾被孢霉；发酵菌粉；活性成分

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）34-168-02

冬蟲夏草（Chinese cordyceps）在分类学上属于子囊菌亚门、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，是一种传统的中草药和保健品[1]。虫草中含有多种活性成分，如虫草多糖、核苷、甾醇等[2]。现代医学已经证实了虫草具有清除自由基[3]、抗肿瘤、增强免疫[4]、降低血糖[5]、抗感染[6]等多种药理活性。虫草的多种疗效与其内在化学成分的种类与含量是密切相关的[2]。

近年来，虫草因其特有的生理药理活性已经引起了广泛的关注。然而，野生冬虫夏草资源稀少，仅分布于青藏高原及海拔3 000 m以上、雪线以下的地区。随人工开发力度的增大，野生冬虫夏草资源逐渐趋于匮乏，而虫草的人工栽培较为困难，这些现实问题促使了虫草发酵技术的产生以及规模化生产的快速发展。目前，虫草发酵已经实现了工业化生产，能够满足人民健康的需求。

虫草发酵研究的关键问题之一是菌种。目前已从野生冬虫夏草中分离得到了众多冬虫夏草菌，其中，用于虫草发酵研究与开发的菌种主要有中国被毛孢（Hirsutella sinensis X.J.Liu，Y.L.Guo，Y.X.Yu & W.Zeng）、虫草头孢（Cephalosporium sinensis Chen）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepialid C.T.Chen & B.Liu）等[7-8]。利用相关菌种已研发出相应的一系列保健品，并形成了一定的产业规模，有关虫草发酵菌粉的成分研究也已经开展。然而，各种发酵菌粉中的活性成分以及相应的药理活性尚需要进一步鉴定与比较。笔者在此对虫草头孢和蝙蝠蛾被孢霉2种发酵菌粉中的多糖、核苷、多酚及三萜类物质进行了测定，比较这些活性组分在种类及含量上的差异，为虫草发酵菌种的开发提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫草菌粉。

虫草头孢、蝙蝠蛾被孢霉发酵菌粉均由国内某企业提供。

1.1.2 试剂。

齐墩果酸、没食子酸标准品购于中国食品药品检定研究院。其余试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器。

UV2100紫外分光光度计，上海Unico仪器有限公司；气相色谱仪（GC2010），日本Shinadzu公司；高效液相色谱仪（HPLC），美国Agilent公司；ICS5000离子色谱仪，美国Dionex公司；高速冷冻离心机，Sigma公司；真空干燥仪，美国Savant公司。

1.2 方法

1.2.1 虫草多糖含量及单糖组成分析。

采用重量法测定虫草多糖含量。取虫草菌粉1 g加入20 ml去离子水，90 ℃水浴0.5 h，冷却后离心收集上清。重复该过程3次并合并上清。上清液浓缩后，缓慢滴加无水乙醇至乙醇含量达75%，4 ℃过夜后离心，沉淀干燥至恒重后称重。

准确称取5 mg多糖加入到2 ml 2 mol/L HCl溶液中，95 ℃水浴5 h后加入等体积的2 mol/L NaOH溶液中和，12 000 r/min离心10 min后取上清进行离子色谱分析。色谱柱为CarboPac PA20；柱温45 ℃；流动相为水∶NaOH溶液（250 mmol/L）=98.2∶1.8（V/V），流速0.5 ml/min；脉冲安培检测器。

1.2.2 核苷类物质含量测定。

称取0.1 g菌粉于EP管中，加入2 ml甲醇-水（1∶1，V/V）溶液，超声提取 30 min后静置过夜，12 000 r/min离心后取上清过滤膜供分析。色谱柱为Diamonsil C18（4.6×250 mm）；流动相为甲醇∶去离子水∶磷酸=5∶95∶0.05（V/V/V），流速0.8 ml/min，260 nm紫外检测；柱温30 ℃。

1.2.3 总多酚含量测定。

准确称取菌粉5.0 g于250 ml三角瓶中，加入50 ml 70%乙醇超声提取30 min，重复操作3次并合并滤液，并定容至100 ml。取待测样品溶液1.0 ml，再分别依次加1.0 ml FolinCiocalteu试剂及1.0 ml 10% Na2CO3溶液，然后用蒸馏水定容至5.0 ml，在室温下静置30 min后用0.5 cm光径比色杯在波长为765 nm的条件下进行比色测定，以空白试剂为参比[9]。根据没食子酸标准曲线进行总多酚的定量。没食子酸标准曲线为y=0.119 1x+0.053 3（R2= 0.997），其中x为没食子酸浓度（μg/ml），y为吸光值。

1.2.4 总三萜含量测定。

准确称取菌粉0.5 g于2 ml EP管中，加入500 μl甲醇，50 Hz超声15 min后过夜，取甲醇提取液100 μl于10 ml具塞试管中，水浴蒸干，加0.3 ml新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和1 ml高氯酸，60 ℃反应20 min，冰水冷却，加入10 ml冰醋酸，摇匀后在550 nm 波长下测定吸光度，根据齐墩果酸标准曲线进行总三萜含量测定[10]。齐墩果酸标准曲线为y=0.010 1x-0.009 5，其中x为齐墩果酸浓度（μg/ml），y为吸光值。

2 结果与分析

2.1 虫草多糖的分析测定

大量医学试验证实，多糖是冬虫夏草中的重要活性成分之一，可活化巨噬细胞刺激抗体产生，提高免疫，抑制炎症与肿瘤，同时具有修复细胞等功能[11-12]。经检测，虫草头孢和蝙蝠蛾被孢霉2种虫草发酵菌粉中的粗多糖含量相近，分别为6.24%、7.57%。进一步分析单糖组成发现（表1），2种菌粉的单糖相对含量有所差异，但均由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6种单糖构成，其中，半乳糖、葡萄糖和甘露糖为主要组分，约占多糖含量的70%，这与赵秋蓉等[13]研究得出的虫草多糖的单糖组成一致。

2.2 核苷类物质的分析测定

核苷是虫草中的有效成分之一，尤以腺苷具有明显的药理作用，如改善心脑血液循环、防止心律失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等。我国也已将冬虫夏草腺苷含量的测定写入药典[14]。由表2可知，2种虫草发酵菌粉中均检测到了含量较高的胞苷、鸟苷和腺苷，其中，腺苷含量远高于冬虫夏草子实体（1.93 mg/g）及固体发酵冬虫夏草菌丝中的腺苷含量（0.75 mg/g），这与Yang等[15]的研究结果一致。而与其他发酵菌粉相比，虫草头孢与蝙蝠蛾被孢霉发酵菌粉中的腺苷含量显著高于市售蝙蝠蛾拟青霉（金水宝胶囊）、中华束丝孢（百令胶囊）和粉红胶霉（心肝宝胶囊）发酵菌粉。虫草头孢发酵菌粉与市售其他虫草头孢菌粉（宁心宝胶囊）相比，则可能由于生产工艺不同，使得不同来源的发酵菌粉中的含量差异较大[16]。虫草头孢与蝙蝠蛾被孢霉发酵菌粉的核苷物质含量差异不显著。肌苷和虫草素均未检测到。

表2 蟲草菌粉中核苷类物质含量

mg/g

样品胞苷鸟苷肌苷腺苷虫草素

虫草头孢9.882.06N.D.5.34N.D.

蝙蝠蛾被孢霉8.721.87N.D.5.90N.D.

注：N.D.表示未检出。

2.3 总多酚的分析测定

多酚类化合物普遍具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、保护心脑血管系统等药理活性[17]。经测定，2种虫草发酵菌粉中均含有较高含量的多酚类物质，虫草头孢中的总多酚含量（5.11 mg/g）略高于蝙蝠蛾被孢霉（4.52 mg/g）。与其他来源虫草相比，多酚含量差异较为显著，这是由于发酵菌种的不同以及发酵条件的差异引起的[18]。

2.4 总三萜的分析测定

三萜类化合物被证明具有抗肿瘤、抑制组织胺释放、抗HIV、抑制胆固醇生物合成与吸收等多种药理学活性[19]。经检测，2种虫草菌粉均含有较高的三萜含量，蝙蝠蛾被孢霉中的含量（8.29 mg/g）略高于虫草头孢中的含量（7.73 mg/g）。

3 结论

该试验对虫草头孢与蝙蝠蛾被孢霉2种虫草发酵菌粉中的多糖、核苷、多酚及三萜类物质进行了测定，比较这些活性组分在种类及含量上的差异。结果表明，2种菌粉中粗多糖含量在7%左右，均由6种单糖构成；2种虫草发酵菌粉中均检测到含量较高的胞苷、鸟苷和腺苷等核苷类化合物，总多酚的含量约5 mg/g，三萜类物质含量约8 mg/g。2种菌粉在这些有效成分的含量上并无显著差异，表明2种菌粉均具有较高的潜在药用活性和良好的开发前景。

参考文献

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[3] 李晓磊，赵珺，李丹，等.冬虫夏草深层发酵菌丝体和蛹虫草子实体抗氧化活性的对比研究[J].食品科技，2009，34（9）：75-78.

[4] 宋林霞.冬虫夏草抗肿瘤作用的研究进展及展望[J].安徽农业科学，2006，34（14）：3387-3388.

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[6] WON S Y，PARK E H.Antiinflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris[J].J Ethnopharmacol，2005，96（3）：555-561.

[7] 劳景辉，闫文娟，方佳茂，等.冬虫夏草发酵技术的研究进展[J].中国食用菌，2012，31（6）：5-7.