超高效液相色谱—质谱法测定豆芽中6曹谢腺嘌呤的方法研究

武婷 薛园园 赵小珍

摘要[目的]建立超高效液相色谱质谱联用法（UPLCMS/MS）测定豆芽中6苄基腺嘌呤（6BA）的方法。[方法]豆芽样品经过酸化甲醇提取，高速离心沉淀分离后，采用超高效液相色谱柱WATERS ACQUITY C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，乙腈和0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱。[结果]6BA在1.0～200.0 ng/ml范围内，线性关系良好，回归系数R2为0.998 4，回收率达到85.3%～93.0%，精密度达到1.39%～2.75%。[结论]该方法稳定，操作简便、快速，提取效率高，重现性好，对豆芽样品中6BA的检测提供了有力的技术支持，有很高的实用价值。

关键词超高效液相色谱-质谱法；豆芽；6苄基腺嘌呤

中图分类号S03文献标识码A文章编号0517-6611（2015）34-088-02

6苄基腺嘌呤（6Benzylaminopurine，6BA）是一种人工合成的细胞分裂素，是使用非常广泛的生长调节剂。6BA作为植物促长剂和果蔬保鲜剂的主要成分，已在国内外进入应用阶段。目前，6BA的应用已经拓展到果树栽培和园艺等领域。作为植物促长剂使用，6BA能提高种子发芽率，促进幼苗生长，最终提高产率，常被用于促进豆芽的生长。用6BA配成不同浓度的水剂，对于农作物可起到调节生长的作用，使水稻和黄瓜增产、增收，并使黄豆芽粗壮且无根。据报道，市场上豆芽中6BA添加超标现象严重。人体摄入过量的6BA会刺激皮肤黏膜，伤害食道和胃黏膜，出现恶心、呕吐等现象。而相关的定量检测方法有常规的紫外分光光度法[1]、液相色谱法[2-7]、液相色谱-质谱法等[8-10]。其中紫外分光光度法检出限高，不能满足痕量检测的要求，而高效液相色谱法灵敏度低、定性能力差、抗干扰能力弱，普通高效液相色谱-质谱法虽然灵敏度较高，但是样品分离时间较长。笔者建立了超高效液相色谱-质谱联用法检测豆芽中6BA的方法，分离时间大大缩短，溶剂消耗量也减小到最低用量，并且具有更高的灵敏度和分离度，对豆芽样品中6BA的检测提供了有力的技术支持。

1材料与方法

1.1材料供试豆芽，市购。主要仪器：ACQUITY UPLC XEVO TQ超高效液相色谱质谱联用仪，美国WATERS公司；PipetLite XLS移液器（Rainin Instrument），LLC a METTLER TOLEDO Company，美国；组织捣碎机（Retsch GM200），德国；高速离心机（TGL16M），湘智离心机。

主要试剂：6BA标准品（纯度99.0%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸，均为色谱纯；实验室用水为超纯水；酸化甲醇，每100 ml甲醇中加入乙酸50 μl，混匀；6BA 标准溶液，精密称取6BA标准品0.100 0 g 于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，此溶液每毫升相当于1.00 mg 6BA。临用时用甲醇稀释至所需的浓度。

1.2色谱条件流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈，具体情况见表1。

色谱柱：WATERS ACQUITY C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；进样量：10 μl；柱温：40 ℃。

1.3质谱条件电离模式：ESI+；扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：450 ℃；锥孔流速：50 L/h；脱溶剂气流速：900 L/h；碰撞气流速：0.17 ml/min；母离子：226.1；子离子：91.1（定量离子），148.0；锥孔电压：35 V；碰撞能量：25 eV，20 eV。

1.4样品预处理试样经组织捣碎机捣碎混匀后备用。取5 g样品（精确至0.01 g）于50 ml聚丙烯离心管中，加入10 ml酸化甲醇，用均质机均质3 min，10 000 r/min离心10 min，上清液转入50 ml容量瓶中，样品再用20 ml酸化甲醇重复提取2次。合并上清液，用水定容至刻度，摇匀，吸取2 ml于10 ml容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，经0.2 μm滤膜过滤，供UPLCMS/MS分析。

1.5方法学试验

1.5.1线性关系。准确称取5 g（精确至0.01 g）未添加6BA的豆芽匀浆液，准确加入6BA的对照品溶液，使豆芽样品中6BA的浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/ml，按照“1.4”方法进行样品处理，按照色谱、质谱方法进样，记录MRM图，得峰面积。得到线性回归方程和相关系数。

1.5.2检出限与定量限。准确称取5 g（精确至0.01 g）未添加6BA的豆芽匀浆液，准确加入6BA的对照品溶液，使豆芽样品中6BA的浓度为0.1、0.2、0.5 ng/ml，按照“1.4”方法进行样品处理，按照色谱、质谱方法进样。记录MRM图中定量离子的信噪比，以3倍信噪比计算得出检出限，10倍信噪比计算得出定量限。

1.5.3回收率和精密度测定。平行称取18份5 g（精确至0.01 g）未添加6BA的豆芽匀浆液，准确加入100 μl 10.0、50.0、100.0 ng/ml 6BA的标准品溶液，每个浓度平行6份，使豆芽样品中6BA的添加量为0.2、1.0、2.0 μg/kg，按照“1.4”方法进行样品处理，按照色谱、质谱方法进样，计算每个浓度下的回收率，同时计算相对标准偏差。

2结果与分析

2.1线性关系选用6BA的溶液浓度为1.0～200.0 ng/ml的样品溶液进样分析，以峰面积为纵坐标、相应浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，见图1。得到标准曲线为y=3 327.1x+60 386，r2=0.998 4。线性关系良好，完全符合方法学要求。6BA标准溶液的MRM图见图2。

2.2檢出限与定量限对豆芽样品中6BA的浓度为0.1、0.2、0.5 ng/ml测定所得的MRM图中的色谱峰进行信噪比计算，浓度为0.1 ng/ml时，信噪比大于3倍空白信噪比，得出检出限为0.1 ng/ml。浓度为0.2 ng/ml时，信噪比大于10倍空白信噪比，得出定量限为0.2 ng/ml。

2.3回收率与精密度选择未添加6BA的豆芽作为空白样品，选择3个浓度的6BA进行加标回收率试验，所得结果见表1。豆芽样品中平均回收率为85.3%～93.0%。根据国家标准GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中对检测方法确认的技术要求中，被测组分浓度含量小于0.1 mg/kg时，回收率在60%～120%，符合方法学的要求。计算每个浓度下平行6次的试验结果，计算相对标准偏差，所得精密度见表1。

2.4实际样品分析采用所建立的分析方法对市场上随机抽查的绿豆芽、黄豆芽等豆芽类样品共10批次进行6BA残留量的定性、定量分析。结果表明，被测的10批次样品中，均未检出6BA。

3结论

该研究建立了豆芽中6BA的超高效液相色谱-质谱联用的检测方法。通过线性关系、检出限与定量限、空白基质中3个浓度的加标回收率和精密度试验等方法学考查，得出该法结果满意，完全符合方法学要求。方法简便、快速、稳定、重现性好，便于推广使用，对于豆芽中6BA的残留监控提供了有力的技术支撑。

参考文献

[1] 吴增茹，李长荣.紫外分光光度法测定6BA的含量[J].中国农业大学学报，1998，3 （3）：87-89.

[2] 赵树兰，韩蕴华，乔艳红，等.豆科植物促长剂中6BA的RPLC研究[J].天津师大学报（自然科学版），1998，18（1）：43-46.

[3] 谢君，张义正.植物内源激素的反相高效液相色谱法测定[J].分析测试学报，2001，20（1）：60-62.

[4] 李小平，陈晓红，姚浔平，等.HPLC法测定豆芽中6BA残留研究[J].中国卫生检验杂志，2005，15（2）：149-151.