烤烟不同生育期蔗糖代谢关键酶基因的表达

马俊红　李军营　马二登　卢秀萍

摘要：为了研究烤烟不同生育期蔗糖代谢的分子特点，采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR法对云烟87在不同生育期的3种蔗糖代谢关键酶基因——转化酶（invertase，Inv）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SuSy）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）基因的表达水平进行分析。结果表明：在烟叶发育前期（团棵期、旺长期）Inv酶基因的表达量较高；SuSy酶基因的在烤烟不同生育期的表达量变化呈单峰曲线，在打顶后表达量最高，之后又降低。SPS酶基因的表达量在烤烟生长发育后期较高，说明烤烟蔗糖的累积主要在发育后期进行。

关键词：烤烟；生育期；蔗糖代谢；转化酶；蔗糖合成酶；蔗糖磷酸合成酶；基因表达

中图分类号：S572.01 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0032-03

烤烟是世界上一种重要的经济作物，烟叶的品质与其糖含量密切相关，水溶性糖与氨基酸发生梅拉德反应可以产生多种香气物质。蔗糖是主要的水溶性糖之一，也是烟草光合作用的主要产物，可以为烟草的生长提供碳源和能量，同时也是细胞代谢的调控因子，可调节转运蛋白、贮藏蛋白和编码酶的基因的表达。与蔗糖代谢密切相关的酶主要有转化酶（invertase，Inv）、蔗糖合成酶（sucrose syn-thase，SuSy）和蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）。SPS是调控植物蔗糖合成的关键酶之一，其活力直接影响光合产物的分配，研究表明其与蔗糖形成呈正相关。SuSy是一种可逆酶，既可催化蔗糖的合成，又可催化蔗糖的分解，通常认为，它主要起分解蔗糖的作用，能为细胞壁提供合成底物和合成淀粉。Inv酶与植物体内形成蔗糖梯度相关，Bachelier等研究表明，处在细胞壁中的转化酶能调节蔗糖从韧皮部卸出，并且控制蔗糖吸收速度，而在液泡中的转化酶则可以调节蔗糖和己糖的贮存。

本研究通过对烤烟品种云87在团棵期、旺长期、现蕾期、打顶后、成熟期5个生育期的蔗糖含量，Inv酶、SuSy酶、SPS酶活性以及3个酶基因的表达情况进行测定，从而明确不同生育期蔗糖代谢主要酶活性及酶基因的变化特点，揭示烤烟不同生育期蔗糖代谢的分子特点，并为改善烤烟品质提供理论依据。

1.材料与方法

1.1供试材料

试验地点设在云南省玉溪研和基地，在移栽后第20天（团棵期）、第40天（旺长期）、第60天（现蕾期）、第80天（打顶后）、第1130天（成熟期）采集云烟87的第12张叶（自下而上），将新鲜烟叶1g放入液氮罐冷冻后，置于-80℃保存备用。

1.2试验方法

1.2.1总RNA的提取

总RNA提取按照RNAiso Plus和RNAiso-mate fnr Plant Tissue试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]说明书进行。用核酸蛋白紫外分析仪检测D260nm/D280nm的比值以鉴定RNA抽提质量，1.8≤D260nm/D280nm≤2.0，表明总RNA质量较好，同时测定其标本总RNA浓度。

1.2.2总RNA的反转录反转录反应用PrimeSeriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]进行，具体方法参照试剂盒说明书。

1.2.3引物设计选择内参基因Actin以及3个关键酶基因（蔗糖合成酶基因、蔗糖磷酸合成酶基因以及蔗糖转化酶基因），按照实时荧光定量PCR扩增的引物设计原则，避免引物3'端互补，以及“发卡”结构，引物的长度为18～22bp，注意碱基的随机分配，GC含量在40%～60%之间，扩增片段小于200bp。并应用Primer3（v.0.4.0）软件设计相应的扩增引物。引物合成由Inviirogen公司完成。引物序列见表1。

1.2.4实时荧光定量RT-PCR分析以受试材料叶片反转录cDNA为模板，Real—time qPCR扩增反应试剂SYBRPremix Ex TaqI（Perfect Real Time）来自宝生物工程（大连）有限公司。Real-time qPCR扩增和分析在Mx3005PQPCR System荧光定量PCR仪（stratagene）上进行，采用96孔反应模块。反应体系：2×SYBR Premix 12.5uL，ForwardPrimer0.4umol/L，Reverse Primer 0.4 txmol/L，Rox1 txmol/L，补充至25uL。扩增反应条件：95 qC 30 s，1个循环；95℃ 5s，58℃ 30s，45个循环；95℃ 30s，58℃ 1min，95℃ 1min，1个循环。PCR反应结束后，65～95℃产生溶解曲线，阈值线由Mx Pro软件自动设定。每个样品重复3次，不同时期样品的表达量检测均在相同的real—time PCR循环中进行，以保证标准样品和处理样品扩增条件一致。

1.2.5数据分析试验结果最少是3次试验的平均值。用2的方法计算待测基因的相对表达水平。其中，各基因在对照情况下的相对表达量设定为1.0。采用Excel 2003进行数据处理与作图，采用SISS 13.0进行统计学分析。

2.结果与分析

2.1烤烟不同生育期蔗糖转化酶基因的表达分析

蔗糖转化酶（Inv）的活性标志着植物叶片对光合产物利用的强度，也是碳代谢的重要标志之一。从图1中可以看出，烤烟蔗糖转化酶基因的表达随着烤烟的生长发育从团棵期到成熟期逐渐减弱，在团棵期Inv酶基因的表达最强，从旺长到现蕾期Inv酶基因的表达量急剧降低，从现蕾期至成熟期表达量维持在较低水平，且相对比较稳定。说明在烟叶发育早期主要由Inv酶催化蔗糖的水解，且在发育的早期烟株对光合产物利用的强度最大。而后期Inv酶基因的表达量降低有助于烟叶蔗糖的累积。

2.2烤烟不同生育期蔗糖合成酶基因的表达分析

蔗糖合成酶是促使蔗糖进入各种代谢途径的关键酶之一。从图2可以看出，云烟87蔗糖合成酶基因的表达量呈先升高后降低的趋势，从团棵期、旺长期到现蕾期逐渐升高，在打顶获普蔗糖合成酶基因的表达量急剧升高，同时达到最大值，到成熟期表达量则急剧下降，说明在烟叶生长后期，蔗糖降解主要通过蔗糖合成酶途径来完成的，而成熟期烟叶需要累积蔗糖，因而SuSy酶基因的表达量下降，有助于烟叶适时成熟。

2.3烤烟不同生育期蔗糖磷酸合成酶基因的表达分析

蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内控制蔗糖合成的关键酶。植物体内蔗糖的积累与SIS活性正相关，SIS还参与植物的生长和产量形成，并在植物的抗逆过程中起重要作用。从图3可以看出，云烟87在团棵期、旺长期、现蕾期3个时期的蔗糖磷酸合成酶基因表达量均较低，而打顶后和成熟期的SIS基因表达量较高，且远高于烟株生长发育前3个时期的表达量，说明烤烟蔗糖的累积主要在烤烟生长发育后期进行。

3.结论与讨论

蔗糖是高等植物光合作用的主要产物，参与蔗糖代谢和积累的酶主要包括蔗糖转化酶、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶。本研究首次应用实时荧光定量RT-PCR的方法，对云南烤烟不同生育期蔗糖代谢和积累过程中的3种主要酶基因的表达情况进行了分析。蔗糖是触发衰老的因子，糖分的积累会抑制光合基因的表达，从而引起烟叶的早衰。Huber曾指出SPS酶活力越高，蔗糖积累的越多。同样，本试验的研究结果也表明，SPS基因表达量在烤烟生长发育前期较低，蔗糖积累相应较少，不会导致烟叶早熟，而在后期表达量较高，蔗糖积累量较多，有利于烟叶适时成熟。

蔗糖转化酶基因的表达随植物生长发育时期的不同而改变，存在时间和空间的差异。Inv被认为参与了植物的生长和器官建成。许多研究表明，一般在植物的分生组织和快速生长的幼嫩的组织和器官中（如幼嫩的叶片、茎、花芽、根尖、幼嫩的果实等）Inv活性较高。同样，本研究也证实了这一结论，Inv酶基因的表达在团棵期和旺长期最强，即在烤烟生长发育的前期，此时烟叶幼嫩，而到后期则该基因的表达量下降。

在烟叶发育早期主要由Inv酶催化蔗糖的水解，到生长后期，蔗糖降解主要通过蔗糖合成酶催化的途径来完成。本研究显示，云烟87在打顶后SuSy酶基因的表达量最高，而这一生育期的Inv酶基因的表达量则较低，说明打顶后蔗糖降解的主要途径通过蔗糖合成酶催化来完成的。而在成熟期Inv和SuSy酶基因的表达量均较低，可能是因为在成熟期烟叶需要累积蔗糖，从而达到适时成熟。

但是，由于蔗糖代谢过程中还涉及到众多的其他酶，同时，人们对基因表达与酶活性的之间对应关系了解的也并不透彻，因此，蔗糖的积累与Inv酶、SPS酶、SuSy酶基因表达以及酶活性的精确关系还有待于进一步的研究。