水杨酸软膏微生物限度检查方法研究

孙荣嵘

【摘 要】目的：建立两种浓度水杨酸软膏微生物限度检查方法。方法：5%水杨酸软膏采用常规法，30%水杨酸软膏采用培养基稀释法进行细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌的检查。结果：计数验证中各试验菌的回收率大于70%，控制菌检查验证可检出试验菌。结论：所建立的两种浓度水杨酸软膏微生物限度检查方法可行。

【关键词】水杨酸软膏 微生物限度 方法验证

5%以上浓度的水杨酸软膏可以促进角质溶解，可用于头癣、足癣及局部角质增生。依据《中国药典（二部）》2010年版等文献[1-2] ，对具有抑菌性的样品进行微生物限度检查时，应尽可能消除其抑菌性，才能真实反映样品被微生物污染的情况。根据两种水杨酸软膏中所含水杨酸浓度不同，采取常规法、培养基稀释法对样品进行细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查并进行方法验证试验。

1材料

1.1 仪器

Nu-425-400E生物安全柜（美国NuAire 公司）；YP-601N电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；SPX-250B-Z 生化培养箱（上海博迅实业有限公司）；PSH-300生化培养箱（中科生命科技有限公司）。

1.2 培养基及样品

营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，营养肉汤培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基（批号分别为1305223，130523，130708，130814，130618，1306032，130911），以上购于北京三药科技开发公司；pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，胆盐乳糖培养基（批号分别为3103272，3103414），以上购于广东环凯微生物科技有限公司。样品为5%水杨酸软膏（批号：150323）、30%水杨酸软膏（批号：150316），均由济南市皮肤病防治院提供。

1.3 试验菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大肠埃希菌[CMCC（B） 44102]，枯草芽孢杆菌[CMCC（B） 63501]，铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]，由山东省食品药品检验所提供，均为第三代菌种。

2方法与结果

2.1 菌液的制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基，34 ℃培养18～24 h。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基，26 ℃培养24～48 h ；上述培养物用0.9%氯化钠溶液10倍梯度稀释成每1 mL含50～100 CFU的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，26 ℃培养5～7 d，用0.9%氯化钠溶液将孢子洗脱，用0.9%氯化钠溶液10倍梯度稀释成每1 mL含50～100 CFU的孢子悬液。

2.2 供试液的制备

取供试品5g，加到含45 ℃左右溶化的的5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10 g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，缓慢加入45 ℃左右的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，充分乳化，制成1：20供试液。取1：20供试液1 mL加到9 mL的缓冲液中，制成1：200 供试液。

2.3 验证试验

2.3.1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证

试验组：①常规法 试验组：取1 mL 1：20的供试液和1 mL 50～100 CFU的试验菌，同时注入平皿中，立即加入相应培养基，细菌于34 ℃培养3 d并计数，霉菌及酵母菌于26 ℃培养5 d并计数。②培养基稀释法 取1：20或1：200供试液1 mL，分别置于5个平皿中，使每个平皿含0.2 mL，再加入1 mL 50～100 CFU的试验菌，照常规法进行验证试验。菌液组：测定所加入的每一种试验菌菌数。供试品对照组：按试验组的方法和条件测定供试品的本底菌数。稀释剂对照组：用相应的稀释液代替供试品溶液，按试验组的方法，加入1 mL 50～100 CFU的试验菌，测定其菌数。各试验菌的平均回收率结果见表1。

结果表明：5%水杨酸软膏对5种试验菌的回收率均高于70%，可以采用常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数检查。30%水杨酸软膏采用常规法，对5种试验菌的回收率均低于70%，表明30%水杨酸软膏不能采用常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数检查，可采用培养基稀释法（1：200供试液，0.2 mL/皿）进行细菌、霉菌及酵母菌计数检查。

2.3.2 控制菌检查方法验证

试验组：①常规法 取1：20的供试液20 mL及1 mL50～100 CFU的金黄色葡萄球菌菌液或铜绿假单胞菌菌液，加到100 mL的营养肉汤或胆盐乳糖培养基中，培养18～24 h后，照2010年版《中国药典》二部控制菌检查方法进行检查。②培养基稀释法 取1：20的供试液20 mL及1 mL50～100 CFU的金黄色葡萄球菌菌液或铜绿假单胞菌菌液，加到200 mL或400 mL的营养肉汤或胆盐乳糖培养基中，照试验组进行试验。阴性对照组：取1：20的供试液20 mL及1 mL50～100 CFU的大肠埃希菌菌液，同试验组方法和条件进行试验，阴性对照菌应不得检出。试验结果见表2。

结果表明：5%水杨酸软膏可采用常规法进行控制菌检查。 30%水杨酸软膏可采用培养基稀释法进行控制菌的检查，其中，铜绿假单胞菌的检查采用取1：20的供试液20 mL 加到200 mL增菌液的方法，金黄色葡萄球菌的检查采用取1：20的供试液20 mL 加到400 mL增菌液的方法，试验组均检出相应的试验菌，阴性对照组未检出阴性对照菌。

3讨论

在对软膏进行微生物限度检验时，需要掌握好乳化剂、加入平皿前供试液以及注入相应培养基的温度，均应控制在45℃左右，否则供试品容易在平皿中形成乳白色的块状物，影响菌落计数[3]。由于软膏剂的特殊性，处理起来较为繁琐，因此为建立快速有效的微生物限度检查方法，在对软膏进行微生物限度检查时，应尽量采用常规法、培养基稀释法。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典：二部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录 107-116.

[2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2010：351-389.

[3]方李，张心悦，吴晶晶 等.13种软膏剂微生物限度检查的方法验证探讨[J].中国药师，2014：17（9）：1580-1583.