添加植酸酶对米糠消化酶水解产物化学组成及理化性质的影响

陈练　刘强　张文明　安亚南　周定勇　汪勇　庄苏

摘要：研究了植酸酶对米糠消化酶水解产物化学组成及理化性质的影响，并探究养分之间的相互作用。结果表明：植酸酶处理显著增加了米糠液相提取物（sE）的粗蛋白质（cP）和总非淀粉多糖（TNSP）含量（P<0.05），显著降低了sE的粗灰分（Ash）含量和不可溶剩余物（ISR）的CP、Ash含量（P<0.05）。植酸酶处理显著提高了sE的Ca、Mn、zn、cu含量和ISR的zn含量（P<0.05），显著降低了sE的P、植酸磷含量和ISR的P含量（P<0.05）。添加植酸酶显著增加了sE各单糖含量、单糖总量和ISR的葡萄糖含量（P<0.05）。结果提示，植酸酶处理可提高米糠sE的溶解度、蛋白质含量和非淀粉多糖含量，降低其Ash和植酸含量；米糠中植酸和非淀粉多糖对矿物元素都具有较强的结合能力，它们之间的相互作用可能是导致米糠养分消化利用率较低的重要原因。

关键词：米糠；非淀粉多糖；植酸；蛋白质；矿物元素

中图分类号：S816.44 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0198-03

米糠是稻谷主要的加工副产物，富含蛋白质、米糠油和维生素等营养物质。我国米糠年产量超过1200万t，多用于畜禽饲料；但米糠中的非淀粉多糖（non-starchpolysaccha-rides，NSP）含量较高（20%-25%），NSP会阻碍消化酶与细胞内可消化养分的接触，降低养分的消化利用率。NSP酶可降解细胞壁结构，消除其对养分的包被作用，提高养分的消化利用率和动物的生产性能。目前，以葡聚糖酶和木聚糖酶为主的NSP酶在麦类日粮中已得到广泛应用并取得了良好的效果，但这类酶制剂在米糠日粮中的效果却不太理想。鉴于米糠中的植酸和矿物元素含量显著高于其他谷物加工副产物，而植酸和NSP均能与矿物元素形成复合物，因此推测米糠中多糖、植酸、矿物元素及其形成的复合物是导致米糠消化利用率较低的主要原因。本试验旨在研究植酸酶处理对米糠消化酶水解产物中不可溶剩余物（insolubleresidue，ISR）和液相提取物（supernatantextract，SE）化学组成和理化性质的影响，探究养分之间的相互作用，为进一步研究米糠细胞壁组成及酶制剂对米糠NSP的降解作用提供试验材料和依据。

1.材料与方法

1.1材料与主要试剂

新鲜米糠（江苏禾嘉牧业集团提供），用饲料粉碎机粉碎过40目筛，75℃烘箱中烘干8h，索氏浸提脱脂，保存备用。

主要试剂：耐高温α-淀粉酶（NovoNodisk，Termamyl120L）、淀粉葡糖苷酶（NovoNodisk，AMG300L）、胃蛋白酶（Signla，77151）、植酸酶（Sigma，P9792）、乙醚（AR）、乙酸（AR）、无水乙醇（AR）、乙酸乙酯（AR）、1-甲基咪唑（signla，336092）、单糖标准品（Supelco，47267）；主要仪器：鼓风干燥箱、分析天平、SHZ-88台式水浴恒温振荡器、pHS-2型酸度计、WH-4漩涡混合仪、日立z-8000原子吸收光谱仪、岛津GC-14B气相色谱仪等。

1.2米糠消化酶水解产物SE和ISR的制备

参考刘强提取NSP的方法并作调整，具体如下：称取100g脱脂米糠放入烧瓶，加500mL沸水和0.5mL耐高温α-淀粉酶，旋转蒸发仪水浴中水解2h（95℃，40r/min）。冷却至55℃，加入0.5mL淀粉葡糖苷酶，55℃水浴继续水解8h。冷却至37℃，将pH值调节为2.0，加入0.5g胃蛋白酶，37℃水浴水解4h。然后4000r/min离心10min，分别收集上清液和沉淀。在上清液中加入4倍体积的无水乙醇，使体系中乙醇体积分数为80%。室温静置8h，弃去上清液，收集沉淀并用体积分数85%乙醇溶液洗涤2次，每次静置20min，弃去上清液，过滤后将沉淀冷冻干燥即为SE1。将离心后的沉淀用去离子水洗涤3次，75℃烘干8h即为ISR1。

1.3米糠消化酶一植酸酶水解产物SE和ISR的制备

该提取方法与消化酶水解法基本相同，仅在淀粉葡糖苷酶水解完成并冷却至37℃后增加如下步骤：调节pH值至4.5并加入0.2g植酸酶，37℃水浴水解4h（40r/min），其余步骤均同上，由此方法制备SE2和ISR2。

1.4指标测定

参照文献[4]测定米糠、SE和ISR的水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量，淀粉含量测定采用酶水解一DNS法，矿物元素含量测定参照GB/T138852003《动物饲料中钙、铜、铁、镁、钾、钠和锌含量的测定原子吸收光谱法》，植酸磷（phytatephosphorus，PP）含量测定采用三氯化铁沉淀法，黏度测定参照《中华人民共和国药典》所述平氏毛细管黏度计法，NSP测定参考Theander等的乙酰醛醇衍生法（Uppsala法）。

1.5数据统计分析

数据以“平均值±标准差（x±s）”表示，采用SPSS18.0统计软件进行ANOVA单因素方差分析（OIle-wayANOVA，LSD），P<0.05表示差异显著。

2.结果与分析

2.1米糠SE和ISR的理化性质

SE1为乳白色粉末，质地坚硬；SE2为浅黄色粉末，质地疏松。二者均有一定的黏性和吸湿性。室温下SE1和SE2在水中的溶解度分别为4.19%和8.60%，SE1溶液呈淡黄色，SE2溶液呈土灰色。SE1和SE2溶液（浓度为1%）在40qC水浴中的相对黏度分别为1.15和1.35。

2.2米糠及其SE和ISR的常规成分

由表1可知，sE中粗灰分相对含量明显高于米糠，其中SE1中的灰分含量显著高于SE2（P<0.05），而SE2中的粗蛋白（CP）和总非淀粉多糖（TNSP）含量显著高于SE1（P<0.05）。ISR中CP和TNSP相对含量明显高于米糠，与ISR，相比，植酸酶处理显著降低了ISR2的CP和灰分含量（P<0.05），但对TNSP含量影响不显著。经2种酶水解后，所得SE和ISR中均未检测出脂肪和淀粉。endprint

2.3米糠及其SE、ISR的矿物元素含量

由表2可知，米糠中P、Mg、Mn含量较高，其中磷主要以植酸磷的形式存在（占总磷的67.97%），而Ca、Zn、Cu含量较低。SE中矿物元素相对含量均明显高于米糠，其中Ca、Mn、Zn、Cu含量均高于米糠含量的10倍以上。与SE1相比，植酸酶处理显著提高了SE2中Ca、Mn、Zn、Cu的含量（P<0.05），降低了总磷和PP的含量（P<0.05），SE2中未检出PP。除Cu外，ISR中的矿物元素相对含量均明显低于米糠，其中ISR1和ISR2中均未检出Mn，ISR2中未检出PP。植酸酶处理使ISR2中总磷含量显著低于ISR1（P<0.05），但zn含量显著升高（P<0.05），其余矿物元素含量未见显著影响。整体而言，ISR中的矿物元素相对含量均低于SE。

2.4米糠及米糠SE和ISR的单糖含量

由表3可知，米糠中可溶性非淀粉多糖（SNSP）含量较低，仅占米糠TNSP的4.13%，主要由半乳糖和葡萄糖组成；米糠不可溶性非淀粉多糖（INSP）主要由阿拉伯糖和木糖组成，分别占INSP总量的32.99%和45.19%。2种酶水解获得的SE中单糖组成变化不大，均以阿拉伯糖和半乳糖为主。经植酸酶处理后，SE2中的单糖总糖相对含量显著高于SEI（P<0.05）。与米糠相同，2种ISR也都以阿拉伯糖和木糖为主，但均未检出甘露糖。ISR1和ISR2中除甘露糖以外的各单糖含量及单糖总量均显著高于米糠（P<0.05）。除葡萄糖外，植酸酶处理前后ISR的单糖相对含量变化不大（P>0.05），但ISR2中的葡萄糖含量显著低于ISR1（P<0.05）。组成sE和ISR的单糖物质的量的比与米糠相比无明显变化。

3.小结与讨论

本试验获得的2种米糠液相提取物SE1和SE2的黏度较低，可能与其中结合了较多的矿物元素有关。多糖等大分子聚合物中羟基、羧基和氨基等官能团在水溶液中形成氢键或通过范德华力等分子间相互作用是形成黏度的主要原因，矿物离子与上述官能团往往通过配位键和离子键结合，消除或遮蔽有机大分子组分在溶液中的极性，从而降低其黏滞性。

谷物中的植酸主要分布在胚和糊粉层，其形成跟蛋白质、多糖等物质的沉积有关。研究显示，稻谷的糠麸层含有大量的植酸和蛋白质，而植酸可与蛋白质形成多元复合物，pH值是影响其复合物形成的主要因素。在酸性条件下（pH值小于蛋白质的等电点），蛋白质末端的α-氨基和蛋白质侧链的一些基团容易带正电荷，可与带负电荷的植酸结合形成二元复合物。而处于中性或碱性条件时（PH值大于蛋白质的等电点），带负电荷的植酸可通过ca2+、Mg2+、zn2+等二价阳离子的桥键作用与带负电荷的蛋白质结合形成植酸一矿物元素一蛋白质三元复合物。植酸一蛋白质多元复合物的形成，使得蛋白质溶解度降低，进而影响其消化利用率。此外，植酸还可与蛋白酶、淀粉酶等消化酶结合，降低酶的活性，影响蛋白质等养分的消化。本试验中，植酸酶处理使sE中蛋白质含量增加而IStl中的蛋白质含量降低，即增加了可溶性蛋白的含量。植酸酶可破坏植酸一蛋白质多元复合物，释放植酸结合的蛋白质，从而促进蛋白质的消化利用。zi等研究表明，在豆粕中添加0.5%植酸酶使得豆粕蛋白质的水解度由0.22moI/kg增加至1.26mol/kg。Kong等在肉鸡日粮中添加植酸酶（1500U/kg），发现植酸酶对肉鸡的蛋白质效率（8-15d）和蛋白质沉积量（15～22d）有显著的影响。此外，Zeng等的研究也证实，在断奶仔猪低磷日粮中添加植酸酶能显著提高日粮亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和半胱氨酸的表观消化率。

米糠中富含矿物元素，然而单胃动物对米糠中的矿物元素利用率较低。日粮纤维和植酸是影响米糠中矿物元素消化利用的主要因素。植酸的磷酸基团带负电荷，在一定条件下能与二价阳离子结合形成结构稳定、难以溶解的植酸盐，降低矿物元素的消化利用率。植酸酶的作用可破坏植酸一矿物元素复合物，释放出矿物离子，进而提高矿物元素的利用率。Madrid等研究表明，在生长猪低磷日粮中添加植酸酶能显著增加Ca、P、Mg、Cu的消化率，显著增加P、Mg、Cu的沉积率。Bikker等也研究了添加植酸酶对Zn和Cu在猪体内消化率的影响，结果表明，植酸酶能显著增加Zn的消化率，但对cu的消化率无显著影响。不同矿物离子与植酸结合的能力不同，一般来说Zn2+>cu2+>Ca2+，随着二者结合能力的减弱，其形成的植酸盐的稳定性降低，因而植酸酶对cu的作用小于对zn的作用。本试验添加植酸酶使得可溶性ca、Mn、Zn、Cu含量显著升高，与Madrid等、Bikker等的结果较一致。然而本试验中P、Mg的含量呈现下降趋势却较为反常，这可能跟米糠细胞壁复杂的多糖结构有关。此外，反应体系的pH值、矿物元素的种类、植酸与矿物离子的物质的量之比、其他螯合剂的竞争作用都有可能影响植酸与矿物元素的结合导致结果异常。

植酸不但能直接结合谷物中的矿物元素，还可与NSP发生交互作用络合形成多糖一植酸一矿物元素多元聚合物，影响日粮中矿物元素的利用。Pushpanjali等研究发现，日粮纤维能抑制Zn、Fe等矿物元素在体内的吸收和沉积，矿物元素的利用率与日粮中植酸和纤维的含量呈显著负相关。也有研究表明多糖可以直接与矿物元素结合形成多糖一矿物元素复合物。Wang等研究表明，纤维素酶可以提高米糠中Ca的体外溶解率，推测纤维素可能与ca结合形成难溶的复合物。张亚伟的研究也证实，日粮中的Gal与结合态的Cu显著正相关，小肠食糜中的不溶性的Ara、Xyl与结合态的zn、Mn显著正相关。本试验结果显示，经过植酸酶处理的SE中各单糖残基和总的多糖含量均显著增加，可能是植酸酶降解了复合物中的植酸，破坏植酸与多糖的相互作用，释放出与植酸结合的多糖。从整体来看，sE中的矿物元素和植酸磷的含量均明显高于ISR，表明SE与植酸和矿物元素的结合率显著高于ISR，因此推断米糠中的sE和植酸盐可能是影响其矿物元素利用的主要因素。endprint