树突状细胞疫苗联合抗CD27抗体治疗前列腺癌的实验研究

费金璇　吴宇佳　周　莉　朱晟鑫　廖伟斌　韦思明

·论著·

树突状细胞疫苗联合抗CD27抗体治疗前列腺癌的实验研究

费金璇吴宇佳周莉朱晟鑫廖伟斌韦思明★

目的 探讨抗CD27抗体对树突状细胞疫苗的抗前列腺癌功效的影响。方法 将RM-1前列腺癌细胞注入雄性C57BL/6小鼠皮下。4d后，将载瘤小鼠分为4组，分别接受未治疗、树突状细胞疫苗治疗、抗CD27抗体治疗及树突状细胞疫苗联合抗CD27抗体治疗。肿瘤细胞移植后21d，收集小鼠脾脏，分析T细胞活性。测量肿瘤大小，评价抗肿瘤效应。结果 相比于未治疗，其它3种治疗均明显提高了T细胞活性，显著抑制了肿瘤生长，尤其以联合治疗的功效最明显。结论 联合治疗通过提高T细胞活性加强了抗前列腺癌效应。

抗CD27抗体 树突状细胞疫苗 前列腺癌

在西方发达国家，前列腺癌是男性最常见的肿瘤，也是肿瘤死亡的第二位病因［1］。前列腺癌一旦转移，化、放疗等方法效果均不理想。用树突状细胞疫苗治疗晚期前列腺癌是一种新型的治疗方法，有效率达54%［2］。如何加强疫苗的治疗效果已成为研究的重要方向。作者自2014年1月至6月探索抗CD27抗体是否能提高树突状细胞疫苗的抗前列腺癌功效。报道如下。

1　材料与方法

1.1材料 6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠购自上海实验动物中心。小鼠前列腺癌细胞株RM-1来源于上海细胞研究所。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α、白细胞介素4、干扰素γ由R&D Systems公司生产。T细胞分离试剂盒购于Miltenyi Biotec公司。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗CD3、CD11c单抗，藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的抗CD27、CD83单抗，抗CD27单克隆抗体，及测定干扰素γ的试剂盒系BD PharMingen公司产品。铬酸钠由PerkinElmer公司生产。

1.2制作树突状细胞疫苗 从C57BL/6小鼠中分离出骨髓细胞，与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4等一起培养。第7天，骨髓细胞分化为未成熟树突状细胞，然后与RM-1前列腺癌细胞溶解产物（即肿瘤抗原）、肿瘤坏死因子α、干扰素γ等一起培养。24h后，未成熟树突状细胞分化为成熟树突状细胞（即树突状细胞疫苗），也就是上载肿瘤抗原的树突状细胞。通过表型分析证实培养的细胞是树突状细胞。

1.3分析树突状细胞表型 收集未成熟或成熟树突状细胞，用FITC标记的抗CD11c（树突状细胞标志）单抗和PE标记的抗CD83（树突状细胞成熟标志）单抗染色，用流式细胞仪分析CD11c和CD83在细胞上的表达。

1.4分析T细胞上CD27的表达 C57BL/6小鼠未接种树突状细胞疫苗或者皮下接种树突状细胞疫苗（1×106）。3d后，处死小鼠，获取脾脏。用T细胞分离试剂盒从脾细胞中分离出T细胞，然后用FITC标记的抗CD3（T细胞标志）单抗和PE标记的抗CD27单抗染色，流式细胞仪分析T细胞表面CD27的表达。1.5 肿瘤接种及治疗 将2×105个RM-1前列腺癌细胞注射到C57BL/6小鼠的右侧肋腹皮下。4d后，将载瘤小鼠随机分为4组，每组10只。对照组未接受治疗。疫苗治疗组于载瘤后第4天和第11天，将树突状细胞疫苗（1×106）接种于小鼠左侧肋腹皮下。抗体治疗组于载瘤后第4天和第11天，将100μg抗CD27抗体注射到小鼠腹腔内。联合治疗组小鼠在第4天和11天接受疫苗（1×106）皮下注射，在第7天和14天，接受抗CD27抗体（100μg）腹腔内注射。载瘤第21天，处死小鼠，获取脾脏，测量肿瘤大小。

1.6细胞毒性试验 用CD8+T细胞分离试剂盒从脾细胞中分离出CD8+T细胞，以10：1的比例与树突状细胞疫苗混合培养。5d后，收获致敏的CD8+T细胞。RM-1前列腺癌细胞作为靶细胞，与铬酸钠混合培养60min，以便标记上铬。致敏的CD8+T细胞作为效应细胞，以100：1的比例与铬标记的RM-1前列腺癌细胞（即靶细胞）混合培养。4h后，收集上清液，测量铬的释出量。通过公式［（实验组铬释出量－自发铬释出量）/（最大铬释出量－自发铬释出量）］×100，计算出CD8+T细胞对前列腺癌细胞的杀伤率。

1.7干扰素γ的测定 用CD4+T细胞分离试剂盒从脾细胞中分离出CD4+T细胞，以10：1的比例与树突状细胞疫苗混合培养24h。收集上清液，用酶联免疫吸附试验测定干扰素γ水平。

1.8统计学方法 采用GraphPad Prism 4.0统计软件。数据以（x±s）表示。组间数据比较采用单因素方差分析和q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1树突状细胞表面标志 在未成熟树突状细胞，CD11c和CD83的表达率分别是83.2%（即3.4%+79.8%）和3.4%；在成熟树突状细胞（即树突状细胞疫苗），CD11c和CD83的表达率分别是84.1%（即66.7%+17.4%）和66.7%（见图1）。由此可见，所有培养的细胞高表达CD11c（树突状细胞标志），这表明培养的细胞是树突状细胞。相比于未成熟树突状细胞，成熟的树突状细胞表达更高水平的CD83（树突状细胞成熟标志）。

图1　流式细胞仪分析CD11c和CD83在树突状细胞上的表达

2.2用树突状细胞疫苗接种小鼠后，上调了T细胞上CD27的表达 在未接种树突状细胞疫苗的小鼠，仅7.2%的T细胞表达CD27；然而，用树突状细胞疫苗接种小鼠后第3天，47.5%的T细胞表达了CD27（见图2）。

2.3三种治疗方法对肿瘤大小、CD8+T细胞的杀伤率及CD4+T细胞产生干扰素γ水平的影响 见表1。

表 1 各组肿瘤大小、杀伤率及干扰素γ水平的比较（x±s）

图2　流式细胞仪分析CD27在T细胞上的表达

3　讨论

树突状细胞是体内功能最强的抗原递呈细胞，能处理和递呈肿瘤抗原给CD4+和CD8+T细胞，刺激T细胞活化［3，4］。活化的CD8+T细胞能直接杀死肿瘤细胞［5］。活化的CD4+T细胞能释放细胞因子，如干扰素γ，帮助CD8+T细胞活化［6］。静息的T细胞低表达CD27，然而，一旦T细胞活化，CD27表达明显升高［7］。抗CD27抗体与CD27结合为T细胞的活化提供协同刺激信号，进一步提高T细胞的功能［8］。本实验结果显示，用树突状细胞疫苗接种小鼠后，T细胞上调了CD27表达，这为抗CD27抗体的应用提供了理论依据。此外，作者发现，相比于疫苗或抗体的单一治疗，联合治疗显著抑制了肿瘤生长，表明抗CD27抗体加强了疫苗的抗前列腺癌功效。本实验还显示，联合治疗组的杀伤率和干扰素γ水平明显高于单一治疗组，这表明联合治疗提高了T细胞活性。在本试验中，作者使用了成熟树突状细胞（即树突状细胞疫苗）治疗前列腺癌。相比于未成熟树突状细胞，成熟树突状细胞能诱导更强的抗肿瘤免疫反应，产生更好的临床效果［2］，表达更高水平的CD83（树突状细胞成熟标志）。

综上所述，树突状细胞疫苗联合抗CD27抗体通过提高T细胞活性来加强抗前列腺癌功效。这为临床上治疗前列腺癌提供了良好的实验基础和理论依据。

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Objective To investigate whether anti-CD27 antibody can enhance anti-prostate cancer effi cacy of dendritic cell-based vaccine. Methods A prostate cancer model was established by subcutaneous injection of RM-1 prostate cancer cells into male C57BL/6 mice. After 4 days，prostate cancer-bearing mice underwent untreatment or were treated with dendritic cell-based vaccine，anti-CD27 antibody，or combination of dendritic cell-based vaccine with anti-CD27 antibody. Spleens were collected for analysis of T cell activity 21 days after tumor cell implantation. Tumor size was measured for assessment of antitumor effect. Results Three treatments signifi cantly enhanced T-cell activity，and signifi cantly reduced tumor growth compared with untreatment，with the highest effi cacy in combination treatment. Conclusion Combined treatment can strengthen anti-prostate cancer effi cacy by improving T-cell activity.

Anti-CD27 antibody Dendritic cell-based vaccine Prostate cancer

2014年浙江省大学生科技创新活动计划（新苗人才计划）（2014R434009）；2014年浙江省医药卫生科技计划项目（2014KYA051）

310053 浙江医学高等专科学校