雨生红球藻的大规模培养以及虾青素的提取技术

徐青山 李晓香 张 娇 秦玉明 骆其君

（1.程海保尔生物开发有限公司，云南 丽江674202；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波315211）

虾青素是近年来走入国际研发领域的类胡萝卜素。它广泛存在于自然界中，也是海洋动物体内最主要的类胡萝卜素之一。研究表明，虾青素具有强大的清除氧自由基的能力，其抗氧化性是类胡萝卜素的10倍，是维生素E的550倍，被誉为“超级抗氧”[1-2]。鉴于虾青素的抗氧化功能，且对人体的绝对安全性，在国外已被广泛应用于医药，食品，保健及水产养殖业中[3-4]。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）在特定的条件下可积累本身干重的1%以上的虾青素，是天然虾青素“浓缩品”和最好的生物来源[5-6]。

雨生红球藻是一种淡水单细胞微藻，属绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。其具有特殊的生物学性质，即在弱光及营养丰富的条件下，以游动的绿色营养细胞存在，而在不利于其生长的条件下，以不动厚壁孢子存在，同时在体内积累大量的虾青素[7-8]。鉴于雨生红球藻此生长特点，目前国际上成功的生产模式都采用了两阶段生产方式，即先采用封闭式光生物反应器培养系统实现细胞的高密度营养生长、克服污染问题，再采用流行的开放池系统在胁迫条件下使细胞积累虾青素[9]。本项目旨在利用雨生红球藻的培养及虾青素的提取实验中获得的方法，结合现实生产条件，将技术应用到生产实际中，进一步的推广雨生红球藻的大规模培养和虾青素的提取技术。

1 雨生红球藻的大规模培养

目前雨生红球藻的培养主要分为两个阶段：细胞生长繁殖阶段和虾青素的积累阶段。

1.1 细胞生长繁殖阶段

雨生红球藻的生长繁殖阶段采用逐级扩大培养的方式。各级培养所需淡水取自程海湖，营养液配制与补充均采用MAV母液。

1.1.1 一级培养

利用5000ml三角瓶室内密封恒温培养。三角烧瓶使用之前用草酸清洗并用清水冲洗三遍，每瓶加入培养所用淡水，加热煮沸消毒后用牛皮纸和橡皮筋密封并冷却至室温。加入适量营养盐母液后，藻液按1：3的比例接入，接种细胞密度为1000～6000个/毫升，密封培养。光照强度控制在4000～5000lx，每天摇瓶3～4次以保证充足的二氧化碳溶解量，室内温度控制在25～27℃。每天取样计数，监测藻细胞的浓度。待细胞处于指数生长期时，取一部分藻液继续用于一级培养，以保证藻种的规模；一部分用于二级培养，以逐级扩大生产规模。

1.1.2 二级培养

利用50L白色塑料桶密封充气培养。充气系统包括鼓风机，主充气管，支充气管和气石，支充气管和气石需加热煮沸消毒后才可使用。白桶使用之前用消毒水清洗并用清水冲洗干净，加入淡水45L后再加入消毒片消毒。消毒6h后加入适量硫代硫酸钠中和漂白精，待完全中和后加入营养盐母液并接入一级培养至指数生长期的藻种，接种比例根据藻液的浓度确定，并将已加热消毒后的支充气管和气石安装好进行充气，用尼龙塑料和橡皮筋密封。培养过程中光照控制在4000—5000lx。每天计数监测藻细胞密度，待藻细胞进入到指数生长期时，培养至细胞密度为10万～25万个/毫升，扩大至三级培养。

1.1.3 三级培养

利用100～200 m2水泥池搅拌培养。消毒池和搅拌车用消毒水清洗干净后，加入培养所需淡水，高度控制在30～40cm。按照比例均匀加入漂白粉原池消毒过夜。消毒6h后加入适量硫代硫酸钠中和漂白粉，待完全中和后加入营养盐母液并接入藻种，搅拌培养，光照控制在5000～6000 lx。每天计数监测藻细胞密度，培养至雨生红球藻细胞密度达到6万～12万个/毫升，到达适宜密度时用于下一步生产流程。

关于雨生红球藻的大规模培养技术，已取得了一项专利：大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置和简易方法（专利号：ZL200610154678），并有一项专利已受理：一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法（申请号：200910099708.6）。

1.2 虾青素的积累阶段

虾青素的积累阶段需要建特殊的收集池。收集池面积大至和三级培养池相同，约100～200m2，池底要铺表面光滑的瓷砖，并要有一定的坡度，以便冲洗收集。

待三级培养的雨生红球藻到达一定的浓度，将上层活力较好的藻细胞液转移到收集池。三级培养池底层的藻液含有较多的死细胞和杂质，将其丢弃。转移至收集池的雨生红球藻，光照强度控制在10000lx以上，利用搅拌车进行搅拌并加入一定浓度的氯化钠，进行其虾青素的积累过程。待到藻细胞完全变为孢子，上层水体已基本无颜色，便可进行下一步生产程序。

2 雨生红球藻的收集

经过虾青素的积累阶段之后，藻细胞已完全转化为红色孢子，沉入池底，上层藻液已无藻细胞，水色变清。此时将上层清水排至污水处理厂，之后通过较大的水容器连接收集池的排水口和高速连续离心机，进行雨生红尘球藻的收集。收集过程中，用水泵将收集池底的雨生红球藻冲至排水口的水容器，同时利用高速连续离心机对冲出的含雨生红球藻的水体进行离心，完成雨生红球藻的收集过程。

3 虾青素的提取

经过离心收集后的雨生红球藻藻粉，首先进行喷雾干燥，之后利用超声波技术对雨生红球藻进行破壁处理，之后利用虾青素的脂溶性特性，对处理后的藻液进行油溶萃取，萃取后的脂溶液进行离心处理，收集上清液，得到虾青素，虾青素累积可达1.0%以上。在雨生红球藻的收集，虾青素的提取技术方面从扩红球藻的食品加工方面，已取得一项专利：一种红球藻、菊署的食品及其制备方案（专利号：ZL200910099707.7）。

雨生红球藻中虾青素的含量很高，是天然虾青素的最好生物来源，如何大规模的培养雨生红球藻以及从中高效率的提取虾青素已成为生产天然虾青素的重要途径。相比于国外先进的生产技术，我国雨生红球藻的培养及虾青素提取技术尚处于实验起步阶段，本文创新了雨生红球藻的培养及虾青素的提取实验中获得的方法，为国内首次报道，再结合生产实际条件，运用适宜的生产设备，将该技术措施应用到生产实践中，将进一步的推广雨生红球藻的大规模培养和虾青素的提取技术，获得了适应范围广，生长速度快，虾青素累积可达1.6%以上的技术指标，将产生良好的示范效应，推动我国微藻养殖与加工及市场开发相衔接的新型产业链发展。

［1］李晓梦,齐安翔,蔡明刚,等.雨生红球藻室外大体积培养与虾青素积累初步研究[J].厦门大学学报,2006,5：245-249.

［2］庄惠如,陈必链,王明兹,等.雨生红球藻混合营养与异养研究[R].微生物学通报,2000,27：198-201.

［3］蔡明刚,王杉霖,李文权,等.天然虾青素在水产养殖中的应用研究进展[R].台湾海峡,2003,22：377-385.

［4］CrungM D,S ouzaF ML,B orowitzkaM,et a l.Algalca rotenoidsH.S econdaryc arotenoids2.H aematococcuspl uvialisa planosproesasa so astaxanthine sters[J].JA pplph ycol,19,92(4)：165-171.

［5］庄惠如,卢海声,陈必链,等.雨生红球藻营养细胞的虾青索累积[J].水生生物学报,2001,25(4)：376-378.

［6］魏东,减晓南.大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状[J].中国海洋药物,2001(5)：4-8.

［7］殷明焱.雨生红球藻细胞周期及调控研究[J].中科院海洋研究所,1998.

［8］CrungM D,S,Borowitzka,etal.Algalca rotenoids.Secondaryc arotenoids.H aematococcuspl uvialisa planosproesasa so astaxanthine sters[J].JA pplph ycol,1992(4)：165-171.

［9］FischerP,Kl einU.L ocalizationo fn itrogen～assimilatingenz ym es in t he c hloroplasto fC hlamydomonasr einhardtii[J].Pla nt P h ysiol,1988,88(1)：947-952