甲巯咪唑的电化学行为及其与DNA相互作用的研究

杜芳静， 罗贤文， 李晓霞*

(延安大学化学与化工学院，陕西延安 716000)

甲巯咪唑(Thimazole,TMZ)是临床上治疗人甲状腺机能亢进症的常用药物，但过量服用会引发肾炎、肝硬化、皮肤过敏和咽炎发烧等[1]。因此，建立简单、快速、灵敏测定TMZ的方法十分重要。目前测定TMZ的方法有可见分光光度法[2，3]、萃取浮选法[4]、高效液相色谱法[5，6]及电化学分析法[7 - 9]等。采用电化学分析法已分别研究了TMZ在聚四氨基钴酞菁膜修饰玻碳电极上、血红素修饰碳糊电极上及酞菁钴修饰碳糊电极上的电化学行为。碳纳米管因其良好的电化学性能被广泛用于药物、蛋白和DNA等的分析中。

生物体的正常生命活动及突变、癌变等异常生命活动均与DNA密切相关。药物分子与DNA通过各种模式的相互作用方式，影响到基因的调控和表达，因此，研究药物分子与DNA的相互作用具有实际意义[10]。本文研究了TMZ在多壁碳纳米管修饰玻碳电极(MWNTs/GCE)上的电化学行为，建立了测定TMZ的电化学分析新方法。采用线性扫描伏安法(LSV)和紫外光谱法研究了TMZ与DNA之间的相互作用，计算了两者的结合比及结合常数。所建立的方法简单、快速、灵敏，可望用于实际药物的分析检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器公司)，三电极系统：工作电极为多壁碳纳米管/玻碳电极(MWNT/GCE)或玻碳电极(GCE)，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为铂丝。紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)。

多壁碳纳米管(MWNTs，纯度>95%，深圳纳米港)。甲巯咪唑(TMZ)标准储备溶液：准确称取TMZ标准品(中国药品生物制品检定所)0.0571 g，溶于水，定容于100 mL棕色容量瓶中，浓度为5.0 mmol/L，于阴冷处避光保存。鲱鱼精DNA(hsDNA，上海伯奥)，其纯度计算参考文献方法[10]。

1.2 实验方法

GCE的预处理和MWNTs的酸化处理分别参考文献方法[11]。称取3 mg处理好的MWNTs，加入3 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，超声分散2 h形成悬浊液。吸取5 μL 1 mg/mL悬浮液滴涂在处理好的GCE上，晾干即得MWNTs/GCE。

先将MWNTs/GCE在pH=7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行循环伏安(CV)扫描(0～0.6 V)，直至曲线稳定为止。然后置于不同浓度的TMZ溶液中，记录0～0.6 V范围的CV曲线和LSV曲线。在研究TMZ与DNA的相互作用时， 固定TMZ的浓度为50 μmol/L，加入不同浓度的DNA进行分析。最后固定DNA的浓度为10 μmol/L，加入不同浓度的TMZ，进行结合比、结合常数测定。紫外光谱的测定参照文献方法[12]。

2 结果与讨论

2.1 TMZ在MWNT/GCE上的电化学行为及其分析测定

2.1.1TMZ的电化学行为图1为GCE和MWNTs/GCE在PBS(pH=7.0)和TMZ溶液中的循环伏安图。由图中曲线a和d可以看出，在电位0～0.6 V范围，GCE和MWNTs/GCE在PBS中未发现任何峰。GCE分别在300 μmol/L(曲线b)和500 μmol/L(曲线c)TMZ溶液中扫描时，在0.31 V处有一不可逆氧化峰，且随TMZ浓度的增大峰电流变大。 MWNTs/GCE分别在300 μmol/L(曲线e)和500 μmol/L(曲线f)TMZ溶液中扫描时，在0.29 V处有一不可逆氧化峰。比较曲线e、f和b、c发现，TMZ在MWNT/GCE上的氧化峰较裸GCE上负移100 mV，氧化峰电流增大约4倍。分别将MWNTs/GCE和GCE进行循环伏安和电化学阻抗表征，结果表明，MWNTs/GCE在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的电位差△E和电化学阻抗Ret值，较GCE明显降低，表明修饰电极能提高电子的传递。根据Randles-Sevcik方程，测定出MWNTs/GCE有效面积是GCE的2.1倍，说明修饰MWNTs明显增加了电极的有效面积，使得电极的导电性增强，TMZ在修饰电极上更易被催化氧化。

2.1.2多壁碳纳米管滴涂量的选择MWNTs/GCE上MWNTs的滴涂量影响待测物质的电化学响应。实验考察了MWNTs的滴涂量在2～10 μL之间对电化学信号的影响。研究发现，当滴涂量为8 μL时，TMZ的氧化峰电流达到最大。继续增大滴涂量，TMZ峰电流略有减小。因此，实验中选择8 μL为最佳滴涂量。

2.1.3底液及pH的选择研究了TMZ在B-R缓冲溶液、PBS、NaOH溶液等不同底液中的电化学行为。结果发现TMZ在PBS中峰形最好。因此，本实验选择PBS为底液。考察TMZ在pH=5.8～8.0的PBS中的LSV图(图2)，发现TMZ的峰电位随pH的增大而逐渐负移，峰电流随pH的变化，分别在pH为6.0 和7.0 时出现了两个峰电流极大值，可能此条件下TMZ开始大量以Rs-形式存在，更易发生氧化，因而峰电流突然增大，这一结果与文献报道[8]一致。实验选择pH=7.0的PBS为底液。同时发现TMZ的峰电位随着pH的增大负移，说明有质子参与TMZ的氧化反应。TMZ的峰电位E与pH呈良好的线性关系，线性方程为:Epa=-33.38pH+555.31，r=0.9951，斜率为33.38 mV/pH。将测定斜率值33.38 mV/pH 与理论斜率59.2 mV/pH相比较可知，TMZ的氧化反应是等电子对应等质子的反应[12]。

图1 甲巯咪唑在裸GCE(a、b、c)和MWNTs/GCE(d、e、f)上的循环伏安图Fig.1 Cyclic voltammograms of TMZ on bare GCE(a，b，c) and MWNT/GCE (d，e，f) in pH=7.0 PBSa,d:cTMZ =0;b,e:cTMZ=300 μmol/L;c,f:cTMZ=500 μmol/L;scan rate:100 mV/s.

图2 不同pH值下TMZ的线性扫描伏安图Fig.2 Linear sweep voltammograms of 100 μmol/L TMZ obtained in different pH buffer solutiona-h:pH:5.8,6.0,6.2,6.6,7.0,7.4,7.8,8.0.

图3 不同扫速下TMZ在MWNTs/GCE上的循环伏安图；内插图为峰电流(a)和峰电位与扫速的关系曲线Fig.3 Cyclic voltammograms of 300 μmol/L TMZ obtained in PBS (pH=7.0) at different scan rates from 50～400 mV/s at the MWNTs/GCE;Insert:the linear relationship with scam rate of peak currents(a) and peak potential(b)

2.1.4扫速的影响考察了扫描速度对TMZ峰电流及峰电位的影响。从图3可以看出，峰电流和峰电位均随扫速的增加而增大。扫速v在50～400 mV/s范围，TMZ的峰电位Ep与lnv1/2呈线性关系，线性方程为：Ep(V)=0.126+0.0138lnv1/2，r=0.9954。TMZ的峰电流Ipa与v1/2呈良好的线性关系，其线性方程为：Ipa(μA)=2.57v1/2-11.05，r=0.9992，表明TMZ在MWNT/GCE上的电化学氧化过程是受扩散控制的电极反应过程，计算出修饰电极在TMZ溶液中的扩散系数为9.12×10-8cm2/s。根据电化学动力学原理[13]，以lgIpa对lgc作关系曲线，线性方程为：lgIpa=1.027lgc-0.6587(r=0.9950)。斜率为1.027，接近1，表明TMZ在MWNT/GCE上的氧化反应为准一级反应。实验中选择扫速为100 mV/s。

2.1.5工作曲线和检出限在优化实验条件下，利用MWNTs/GCE对TMZ进行测定。图4为不同浓度的TMZ在MWNTs/GCE上的LSV图。TMZ的氧化电流Ipa与其浓度c在3.0～100 μmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为：Ipa(μA) =-0.1019+0.2501c(mol/L)，r=0.9988，检出限(S/N=3)为1.0 μmol/L。同一支修饰电极对30 μmol/L的TMZ平行测定11次，相对标准偏差为3.3%，表明该修饰电极具有良好的重现性。

2.2 TMZ与hsDNA相互作用的研究

基于TMZ的电化学行为，研究了TMZ与DNA的相互作用。图5为MWNT/GCE在TMZ溶液及加入了不同浓度DNA溶液中的LSV图。结果发现，在0.1～0.6 V范围内TMZ有一不可逆氧化峰，加入DNA后未见新峰，但是TMZ的峰电流明显降低，峰电位略有正移(Ep=0.335 mV→Ep=0.336 mV,△E=1 mV)。在50～200 mV/s扫速范围内，研究扫速与峰电流的关系。发现存在DNA时，峰电流与扫速的平方根成正比，表明该电极过程也受扩散控制。 根据扫速与TMZ-DNA峰电流的关系：Ipa(μA)=0.22v1/2-0.69(v,mV/s)，计算出MWNTs/GCE在TMZ-DNA溶液中的扩散系数为2.67×10-8cm2/s。与TMZ溶液相比(9.12×10-8cm2/s)，TMZ-DNA溶液中的扩散系数减小，表明TMZ与DNA发生了嵌插作用，形成了TMZ-DNA复合物，由于复合物的相对分子质量较大，引起扩散系数减小，峰电流降低[14]。

测定了DNA、TMZ及TMZ-DNA体系在200～400 nm波长范围的紫外吸收光谱(图6)，260 nm 处有DNA的吸收峰(曲线a)，TMZ的吸收峰波长为251 nm(曲线b)。加入DNA 后TMZ的波长略有红移(λ=252 nm)且吸光度值增加，为红移增色效应。根据Long理论，增色效应、红移现象是该物质与DNA发生了嵌插作用。说明TMZ嵌插入到DNA双链之间，引起碱基之间的疏水作用力和范德华力发生改变，影响了DNA构象与结构的稳定，从而引起紫外光谱红移增色[15]。此结论与本实验电化学研究结果一致。

图4 TMZ在MWNT/GCE上的线性扫描伏安图Fig.4 Linear sweep voltammograms of TMZ at MWNT/GCE in PBScTMZ:a.3 μmol/L;b.5 μmol/L;c.8 μmol/L;d.10 μmol/L;e.30 μmol/L;f.50 μmol/L;g.80 μmol/L;h.100 μmol/L.Inser:the resulting calibration curve.

图5 TMZ与DNA作用的线性扫描伏图Fig.5 Linear sweep voltammograms of interaction between TMZ and herring sperm DNAcTMZ=50.0 μmol/L;a.cDNA=0;b.cDNA=5.0 μmol/L;c.cDNA=10.0 μmol/L.

实验中利用LSV法考察并计算了TMZ与hsDNA的结合数m和结合常数b[16，17]。固定DNA浓度为10 mmol/L，改变TMZ浓度得到峰电流的变化曲线，图7中曲线a，b分别为加入DNA前后的峰电流Ip与TMZ浓度的关系曲线；曲线c为a和b的峰电流差值△Ip与TMZ浓度的关系曲线。假定TMZ与DNA只形成一种简单的缔合物DNA-mTMZ，则反应式为：

经推导可得到：

lg[△Ip/(△Ipmax-△Ip)] =lgβ+mlgcTMZ

式中,△Ipmax为加入DNA前后TMZ峰电流差值(△Ip)的最大值(△Ipmax=2.52 mA)。

若TMZ和DNA只形成单一缔合物，则lg[△Ip/(△Ipmax-△Ip)]～lgcTMZ的关系曲线应为一直线。如图7，线性方程为：lg[△Ip/(△Ipmax-△Ip)]=6.997+1.54lgcTMZ(c,mol/L)，r=0.9968；由曲线斜率求得结合数m≈2，由截距求得b=9.93×106L/mol，表明DNA与TMZ形成1∶2型缔合物。

图6 紫外吸收光谱 Fig.6 UV absorption spectra PBS(pH=7.0);a.cDNA=50.0 μmol/L;b.cTMZ=50.0 μmol/L; c.cTMZ=50.0 μmol/L.cDNA=50.0 μmol/L.

图7 DNA加入前(a)与加入后(b)Ip与cTMZ及△Ip与cTMZ(c)的关系曲线图Fig.7 The relationship of Ip with cTMZ before (a) and after (b) the addition of DNA and of △Ip with cTMZ(c)

3 结论

本文基于多壁碳纳米管修饰玻碳电极研究了TMZ的电化学行为，并建立了快速灵敏测定TMZ的电化学分析新方法，对TMZ与DNA的相互作用进行了探索。与裸玻碳电极相比，多壁碳纳米管修饰电极上TMZ的峰电流显著提高。hsDNA与TMZ发生嵌插作用，结合形成1∶2型的嵌合物，其结合常数β为9.93×106L/mol。